21 3.5. Xác định lƣợng photpho trong hạt bằng phƣơng pháp sinh hoá Dùng phƣơng pháp tách chiết từng hạt theo Chen và ctv (1956) thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng. 3.5.1. Phƣơng pháp thực hiện Chuẩn bị pha dung dịch Chen’s : Bảng 3.2. Thành phần các hóa chất trong dung dịch Chen’s Thể tích (theo tỷ lệ) Thành phần 1 1 1 2 6N H 2 SO 4 2.5% Ammonium Molybdate 10% Axit Ascorbic H 2 O Chuẩn bị thang photpho chuẩn cho thí nghiệm 96 giếng. Thang photpho chuẩn này đƣợc thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng và dùng để so sánh với mẫu phân tích của các dòng lúa khác. Ngoài ra cần lƣu ý là dung dịch Chen’s và thang Photpho chuẩn phải đƣợc pha mới từng ngày. Thang chuẩn Photpho đƣợc pha theo 5 mức sau: Bảng 3.3. Thang photpho chuẩn theo 5 mức Mức µl 1mM K 2 HPO 4 µl HCl 0.4M µl H 2 O 1 2 3 4 5 0 5 15 30 45 10 10 10 10 10 90 85 75 60 45 22 3.5.2. Tiến hành phân tích Tiến hành bóc hạt lúa để lấy hạt gạo bên trong của các dòng thuộc các giống trên và cho vào từng gói có đánh dấu riêng biệt theo từng dòng.Trong đó bao gồm có 185 dòng OM 1490 đột biến, 165 dòng OMCS 2000 đột biến, 2 dòng bố mẹ của OM 1490 và OMCS 2000, 150 dòng thuộc giống lúa mùa và cao sản. Ngoài những giống trên còn có thêm các giống khác nhƣ lúa hoang, golden rice, huyết rồng, Lpa-1, Lpa-2, Xie Q. Zao dùng làm đối chứng trong phân tích. Những dòng này đã đƣợc đột biến thành công về tính trạng axit phytic thấp. Bƣớc 1: Lấy mỗi dòng 8 hạt, nghiền riêng từng hạt và cho từng hạt đã đƣợc nghiền vào từng giếng theo hàng dọc. Bƣớc 2: Cho vào mỗi giếng 200 µl HCL 0.4M và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 3: Trích từ mỗi giếng 10 µl sang giếng mới, sau đó thêm vào 90µl H 2 O vào mỗi giếng. Thêm vào 100µl dung dịch Chen’s vừa mới pha. Bƣớc 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tiếng. Kết quả đƣợc so sánh với thang Photpho chuẩn. Hạt càng xanh đậm đƣợc đánh giá là hạt có hàm lƣợng axit phytic càng thấp nghĩa là khoáng vi lƣợng càng cao. Hình 3.1. Thang photpho chuẩn 23 3.6. Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử. 3.6.1. Phân lập DNA từ mẫu lá lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002 ) Lấy mẫu lá: Mô lá lúa non, khỏe đƣợc lấy trên từng cá thể riêng lẻ sau khi đã gieo đƣợc 10 ngày cho vào ống tube, ghi nhãn cẩn thận và đƣợc đặt trong thùng đá. Ly trích DNA: Ở đây DNA đƣợc ly trích theo phƣơng pháp CTAB. Có thể tiến hành ly trích DNA theo những phƣơng pháp khác đơn giản hơn, tuy nhiên phƣơng pháp này cho ra kết quả tinh sạch hơn. Giới thiệu phƣơng pháp CTAB 1.Cắt lá nhỏ và nghiền trên cối. 2.Thêm 660µl dung dịch ly trích. 3. Đặt vào đá 30 phút. 4.Thêm 40µl của 20 % SDS. Ủ trong water bath khoảng 10 phút ở nhiệt độ 65 o C (nhớ phải lắc). 5. Thêm 100µl của 5M NaCl và trộn thật kỹ . 6.Thêm 100µl CTAB, trộn kỹ. 7. Ủ trong water bath khoảng10 phút ở nhiệt độ 65 o C. 8. Chuyển mẫu vào tube mới (1,5ml or 2 ml)(có thể không chuyển). 9. Thêm 900µl cloroform : isoamyl alcohol = 24 :1 và ly tâm 12000 vòng trong 3 phút. 10.Chuyển supernatant vào một tube mới 2.0 và thêm vào 600ul isopropanol. 11. Ly tâm 5 phút (12000rpm) 12. Bỏ supernatant chỉ giữ lại pellet. Rữa cồn 70% trong 2 lần và phơi khô 13. Thêm 50 µl TE vào DNA và trữ ở nhiệt độ -20 0 C 24 Vai trò của một số chất ly trích 1. Chất phá vỡ màng tế bào : Màng tế bào cấu tạo là lớp lipid kép đƣợc phá vỡ bằng chất tẩy. Ví dụ: SDS (sodium dodecylsulfat, lauryl sulfat, 2- mercaptoethanol. Trong đó 2- mercaptoehanol có tác dụng phá màng mạnh. Trong dung môi chiết luôn hiện diện 2 chất là EDTA và Tris. EDTA: có tác dụng gắn chặt ion Mg ++ . Vì các enzym nuclease muốn hoạt động cần Mg ++ làm cofactor, do đó EDTA gắn chặt với Mg ++ làm bất hoạt enzym này góp phần bảo vệ DNA. Tris: có tác dụng đệm rất hiệu quả giúp dung môi luôn giữ ở pH 8 vì ở pH đó DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid purin rất dễ bị loại thải. 2. Chất loại tạp ( protein, polysaccharid…): Để loại bỏ tạp chủ yếu là protein sử dụng tác nhân biến tính protein ( dung dịch chloroform : isoamyl alcohol = 24:1). 3. Chất tủa DNA: DNA đƣợc thu ở dạng cô đặc vừa bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của enzym vừa hòa tan lại chúng với nồng độ mong muốn. Có 3 cách tủa: Tủa trong ethanol: đƣợc thực hiện trong điều kiện nồng độ muối cao, thể tích ehanol cao ( 2 – 2,5 lần thể tích mẫu ) ở nhiệt độ thấp ( - 20 o C ). Trong điều kiện này hầu hết toàn bộ acid nucleic đƣợc tủa. Tủa trong isopropanol: không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol thấp ( 0,6 thể tích mẫu ). Các DNA trọng lƣợng phân tử thấp không bị tủa do đó có thể loại bỏ chúng khi tủa bằng isopropanol. Tủa bằng CTAB ( cetyltrimethylammonium bromid): 25 CTAB là 1 chất tẩy cation dƣơng. Việc kết hợp CTAB với DNA gồm 2 bƣớc: (1) chất tẩy là ion dƣơng nên sẽ bám lên phần điện tích âm của DNA ( do gốc PO - 4 tạo ra). Tác động tĩnh điện của CTAB lên DNA làm giải phóng 1 ion Na + . Vì vậy với nồng độ muối Na thấp hơn 0,7 M thì CTAB kết hợp với DNA, phức này tan trong dung dịch nồng độ muối cao. Ở nồng độ muối cao hơn 0.7 M, CTAB sẽ tạo phức với protein và polysaccharid mà không tạo tủa với DNA. Do đó CTAB rất hữu dụng trong quá trình tinh khiết DNA từ những cơ quan có nhiều polysaccharid (vd: thực vật, vài vi khuẩn Gram (-)) . Có 2 cách sử dụng CTAB:  Để tủa DNA bộ gen: CTAB đƣợc thêm vào dịch trích DNA với nồng độ muối > 0,7 M. Sau khi loại bỏ phức CTAB/polysaccharid/ protein bằng CHCl 3 và phenol, DNA đƣợc phục hồi từ phần dịch nổi bằng cách tủa với isopropanol hoặc ethanol.  Sau khi tủa DNA đƣợc thu nhận lại bằng cách ly tâm, cặn đƣợc rửa bằng ethanol 70% để loại bỏ dấu vết muối, CTAB, isopropanol là những chất có thể ức chế phản ứng SSR. 3.6.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA DNA đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng cách điện di trên gel agarose 0.8 %.  Gel 0,8% trong dung dịch TAE 1X, đƣợc nấu để hòa tan agarose, để nguội đến nhiệt độ 65 0 C. Đổ gel vào khay có gắn sẵn lƣợc tạo giếng trên gel.  Khi gel cứng, lấy lƣợc ra khỏi gel và đặt gel vào khay điện di trong dung dịch TAE 1X.  Lấy 8-10 l dung dịch DNA trộn với 2-4 l dung dịch lắng (Loading buffer) bơm vào giếng trên gel.  Nhuộm gel trong dung dịch có ethidum bromide 0,5% khoảng 10-20 phút.  Chụp gel dƣới tia UV và đánh giá dựa trên các vạch trắng xuất hiện: Nếu DNA có chất lƣợng thì giống vạch lamda phage chuẩn. Nếu DNA lẫn tạp và bị gãy sẽ thấy có vệt trắng kéo dài trên gel. 26 Hình 3.2. Kết quả DNA đã ly trích đƣợc kiểm tra chất lƣợng trên gel agarose 0,8% 3.6.3. Phân tích SSR Microsatellite là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản, thƣờng xảy ra một cách ngẫu nhiên trong hầu hết các genome thực vật. Marker SSR đƣợc viết tắt từ chữ simple sequence repeats. Do đó SSR có thể đƣợc khuyếch đại trong ống nghiệm bằng phƣơng pháp PCR với tính phát triển của primer theo miền của hai bên trên một locus. Kỹ thuật ứng dụng SSR rẽ tiền hơn kỹ thuật RFLP. Do đó các nhà nghiên cứu tiếp tục dùng SSR thiết kế bản đồ gen trong di truyền, chọn lọc giống bằng SSR, đa dạng hoá các vật liệu di truyền. Phản ứng PCR cho SSR Giống nhƣ phƣơng pháp RAPD, một phản ứng PCR cho SSR baogồm các thành phần sau: 1. Một dung dịch gọi là buffer, chứa Tris-HCl, KCL và MgCl2 2. Bốn deoxynucleotide (dNTPs) 3. Hai oligonucleotide primers 4. DNA 5. Một DNA polymerase Thể tích cần cho một PCR của SSR có thể là 15-50 l là đủ. DNA có thể ly trích từ nhiều phƣơng pháp khác nhau. Tuy nhiên trƣớc khi dùng DNA, điều quan trọng là nồng độ DNA về số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng phải đƣợc kiểm tra. Nồng độ dùng cho SSR từ 25-30ng/ l. Nếu nồng dộ quá cao, chúng ta phải pha loãng trƣớc khi sử dụng. 27 3.6.3.1. PCR dùng cho một phản ứng Bảng 3.4. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR Thành phần Pha dung dịch Thể tích ( l) Nồng độ sau cùng Ghi chú H 2 O 12,5 PCR buffer 10X 2 1X dNTP 1mM 2 100 M Primerforward 5 M 1 0,25 M Primer reverse 5 M 1 0,25 M Tag polymerse 5unit/ l 0,5 2,5unit DNA 25ng/ l 1 25ng/phản ứng Tuỳ theo nồng độ DNA 3.6.3.2. Phƣơng pháp tiến hành Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: 1.Các thành phần dung dịch dùng thƣờng đặt trong tủ lạnh –20 0 C hoặc –80 0 C. 2.Ghi nhãn cẩn thận trên ống nghiệm 0,5ml hoặc trên micro tap (một loại đặc biệt dùng để chạy PCR ) 3.Chuyển 1 l của mẫu DNA vào ống nghiệm. 4.Chuẩn bị pha dung dịch cocktail cho phản ứng PCR. 6.Dùng pipette lấy 19 l cho mỗi phản ứng trong ống nghiệm có chứa sẵn DNA. 7.Lấy một giọt dầu (mineral oil) phủ trên dung dịch. 28 8. Đặt ống nghiệm vào máy PCR, đậy nắp máy và khởi hành cho máy hoạt động. 9.Chu trình hoạt động của máy nhƣ sau: Bảng 3.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chƣơng trình Kiểu Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian 1 94 0 C 5phút 2 Chu kỳ 94 0 C 1phút 55 0 C 1phút 72 0 C 2phút 35 3 72 0 C 5phút 4 4 0 C 10.Lấy mẫu ra khỏi máy,khi hoàn thành chu kỳ 11.Dự trữ ở nhiệt độ 4 o C 12.Phân tích mẫu trên gel agarose 3% hay gel acrylamide 3.6.3.3. Phân tích mẫu trên gel Agarose Giống nhƣ các phƣơng pháp RAPD, STS. Agarose đƣợc nấu cho tan, với nồng độ 3%. Tùy theo thể tích của khung điện di mà tính toán số lƣợng agarose cho phù hợp. Các bƣớc thực hiện:  Cân 7,5g agarose cho vào bình tam giác thể tích 500ml.  Pha dung dịch TBE 1X  Cho 300ml TBE 1X vào bình tam giác và đun sôi đến thể tích 250ml 29 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá tính trạng axit phytic thấp qua phản ứng sinh hóa 4.1.1. Quần thể lúa mùa và lúa cao sản Qua phân tích 20 cá thể thuộc quần thể lúa mùa, kết quả ghi nhận chỉ có giống nếp trung quốc (nếp tóc) và giống Tám Xoan biểu hiện tính trạng axit phytic thấp. Tuy nhiên mức biểu hiện thấp hơn mức 3 theo thang photpho chuẩn (Hình 4.1 và hình 4.2) Phân tích với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic. Kết quả 6 giống có biểu hiện tính axit phytic thấp là OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7, DS 2002. Hình 4.1. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị phosphate tự do (HIP) trên quần thể lúa địa phƣơng và lúa cao sản . Kết quả hình 4.1 cho thấy các cá thể OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7 đều tạo phức màu xanh tƣơng đƣơng với giếng chuẩn thứ 3. Sự biểu hiện này đƣơng đối đồng nhất, tuy nhiên so với các giống đối chứng nhƣ lúa hoang thì sự biểu hiện màu này còn thấp hơn rất nhiều 30 Hình 4.2. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản. Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là Nếp Trung Quốc, DS 2002, OM 5731. Các cá thể làm đối chứng là : Lpa-1, Lpa-2, Xi Q. Zao, Lúa Hoang, Golden rice. Qua kết quả phân tích ở hình 4.2, cá thể nếp Trung Quốc có 1 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 2 theo thang photpho chuẩn, 7 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3. Cá thể OM 5731có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 3 và 4 hạt còn lại tƣơng đƣơng mức 2. Cá thể DS 2002 do phân tích lập lại 3 lần tuy nhiên nhìn chung mức biểu hiện nhƣ sau: 2 hạt thể hiện mức 2, còn 6 hạt còn lại thể hiện ở mức 3. . Cho 30 0ml TBE 1X vào bình tam giác và đun sôi đến thể tích 250ml 29 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá tính trạng axit phytic thấp qua phản ứng sinh hóa 4.1.1. Quần thể lúa. hiện thấp hơn mức 3 theo thang photpho chuẩn (Hình 4.1 và hình 4.2) Phân tích với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic. Kết quả 6 giống có biểu hiện tính axit phytic thấp là. đƣợc đánh giá là hạt có hàm lƣợng axit phytic càng thấp nghĩa là khoáng vi lƣợng càng cao. Hình 3. 1. Thang photpho chuẩn 23 3. 6. Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử. 3. 6.1.