27 Các phƣơng pháp phát hiện PMWaV Sether và c.s. (2001) đã sử dụng kĩ thuật RT-PCR và Southern Blot để phát hiện PMWaV. Mô lá hay rệp được nghiền trong nitơ lỏng và tách chiết RNA tổng số sử dụng Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Mẫu RNA tinh sạch được bảo quản ở -80 0 C cho đến khi sử dụng. cDNA thứ nhất dựa trên vùng gene mã hóa HSP 70 của PMWaV-1 và PMWaV-2 được tổng hợp từ 2,5 – 7 g RNA sử dụng primer tái tổ hợp 223 và 226 cho PMWaV-1 và PMWaV-2; việc tổng hợp thực hiện ở 42 0 C (45 phút) sau đó bất hoạt ở 95 0 C (5 phút). Sau đó phản ứng PCR được tiếp tục trong cùng tube với primer 224 và 225 với chương trình nhiệt như sau: giai đoạn biến tính 94 0 C (4 phút); 45 chu kì 94 0 C (1 phút), 54 0 C (1 phút), 72 0 C (1 phút) và giai đoạn kéo dài cuối cùng 72 0 C (10 phút). Sản phẩm PCR được quan sát trên gel agarose 1% được nhuộm ethidium bromide. Gel chứa sản phẩm khuếch đại được làm biến tính, trung hòa và chuyển lên màng Zeta- Probe GT (Biorad, Hercules, CA) thực hiện Southern blot. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng trong kĩ thật TBIA; Mab 35-6-5 cho PMWaV-1 và Mab 63-2-2 cho PMWaV-2. RT-PCR và TBIA được sử dụng song song để phát hiện PMWaV. Loại bỏ virus Theo Sether và c.s. (2001), PMWaV-1 ở chồi dứa nhiễm bệnh được loại bỏ bằng xử lí nhiệt. Quá trình xử lí nhiệt gồm 2 giai đoạn: 35 0 C trong 24 giờ tiếp theo ngay sau đó là 58 0 C trong 40 phút hay 56 0 C trong 60 phút trong bồn nước (water bath). Lá được cắt khỏi chồi 24 giờ sau giai đoạn 2 xử lí nhiệt. Thực hiện vô mẫu với các khối vuông cắt ra từ chồi ngọn và chồi đỉnh có kích thước 1mm . Các môi trường nuôi cấy khác nhau đã được sử dụng để tái sinh mẫu cấy. Khi rễ phát triển, cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra trồng ngoài đất. Thực hiện việc kiểm tra PMWaV bằng RT-PCR trước đó. Thử nghiệm TBIA đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng 1 – 2 tháng sau khi trồng cây ngoài đất. Kết quả thực hiện cho thấy 92% cây hồi phục ở tất cả các nghiệm thức. 2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc Nhìn chung, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều về bệnh đỏ đầu lá. Các đề tài nghiên cứu chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan mật số rệp và mức độ bệnh ở dứa. Theo kết quả điều tra tình hình bệnh wilt của nhóm điều tra bệnh hại trên dứa 28 thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 cho thấy bệnh wilt xuất hiện ở tất cả các ruộng với tỉ lệ bệnh cao: nông trường Thọ Vực (Đồng Nai) có tỉ lệ bệnh cao nhất: 12,1%, tiếp theo là nông trường Phạm Văn Hai 6% và nông trường Lê Minh Xuân 7%; còn ở Bến Lức (Long An), Tân Phước (Tiền Giang) và Đức Trọng (Lâm Đồng) tỉ lệ bệnh lần lượt là 9,3%, 8,1% và 4,1% (Phạm Văn Khánh, 2004; Võ Thị Mỹ Hân, 2004; và Võ Thị Thúy Huệ, 2004). Phòng trừ bệnh Theo Nguyễn Văn Kế (2000), để phòng chống bệnh wilt cần áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp như: chọn giống ít nhiễm bệnh để trồng (giống Cayenne rất dễ nhiễm bệnh). Với các giống trong nước thì dứa Kiên Giang ít bệnh hơn dứa Bến Lức. Lưu ý không lấy chồi ở những vườn bị bệnh kết hợp với sử dụng thuốc trừ sâu để xử lí chồi trước khi trồng. Khử đất để trừ kiến và rệp. Làm sạch cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và kiến. 29 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung như sau: Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus bằng nuôi cấy ĐST và xử lí nhiệt. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV-1 và PMWaV-2 trên cây dứa in vitro nuôi cấy từ ĐST đã qua xử lí nhiệt bằng kĩ thuật RT-PCR. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 1/3 – 30/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Thí nghiệm tiến hành trên chồi dứa Cayenne in vitro có nguồn gốc khác nhau: Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Cây dứa in vitro cao từ 4 – 5 cm được xử lí nhiệt trong thời gian 30 ngày. Sau đó tiến hành tách ĐST các cây đã xử lí nhiệt để nuôi cấy. Chồi dứa tái sinh từ đỉnh sinh trưởng sau 70 ngày nuôi cấy được kiểm tra virus PMWaV bằng RT-PCR để đảm bảo là cây sạch virus. 3.3.1. Vật liệu 3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy Sử dụng chồi dứa Cayenne bị bệnh wilt gồm 3 giống như sau: Giống 1: giống Trung Quốc do Nông trường Thọ Vực, Đồng Nai cung cấp. Giống 2: giống Thái Lan do Nông trường Phạm Văn Hai, Tp HCM cung cấp. Giống 3: giống Lâm Đồng do Chi cục BVTV Đơn Dương, Lâm Đồng cung cấp. 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như Autoclave, tủ cấy vô trùng, đèn UV, dụng cụ nuôicấy mô… Bình nuôi cấy 500ml, ống nghiệm 2,5x 10 cm Tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350 Kính hiển vi soi nổi Olympus SZ40 30 3.3.1.3. Hóa chất Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) Chất điều hòa tăng trưởng N 6 -benzyladenine [BA] (2mg/l) 3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành Tạo nguyên liệu ban đầu Dùng môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung BA (2mg/l) để nhân chồi 3 giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Sử dụng bình nuôi cấy 500ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường được hấp tiệt trùng bằng Autoclave ở điều kiện 121 0 C, 1,2 atm trong 25 phút trước khi sử dụng. Sau 1 tháng, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy vô trùng. Các bình nuôi cấy được bảo quản trong phòng tăng trưởng ở điều kiện như sau: Nhiệt độ: 24 + 2 0 C Thời gian chiếu sáng: 16 giờ ( từ 6 giờ – 21 giờ) Cường độ ánh sáng: 1000 – 2000 lux Ẩm độ: 55% – 60% Xử lí nhiệt Cây dứa in vitro cao khoảng 4 – 5 cm được cấy chuyền sang môi trường MS trước xử lí nhiệt 2 tuần. Các bình nuôi cấy được đặt trong tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350 (ETC) của TT PTTN ĐH Nông Lâm. Nút đậy cao su của bình được thay bằng nylon chịu nhiệt để tạo điều kiện trao đổi nhiệt tốt. Điều kiện xử lí Nhiệt độ: 37 0 C + 0,1 .Ẩm độ: 55% Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng: 2000 lux Thời gian xử lí: 30 ngày Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Mẫu nuôi cấy là ĐST chồi dứa Cayenne in vitro đã qua xử lí nhiệt và đối chứng là ĐST không xử lí nhiệt. Các thao tác nuôi cấy mô được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy được hấp tiệt trùng ở 121 0 C, 1,2 atm trong 25 phút. Quan sát bằng kính hiển vi soi nổi Olympus, dùng dao lam tách ĐST kích thước 31 0,3 – 1 mm và đặt nhẹ lên bề mặt môi trường. Mỗi ĐST được cấy vào một ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MS . Các ống nghiệm chứa ĐST được bảo quản ở điều phòng tăng trưởng và ghi nhận các chỉ tiêu theo dõi sau 30, 50 và 70 ngày. 3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), 3 yếu tố, 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chồi tái sinh từ ĐST. Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của ĐST chồi dứa Cayenne Nghiệm thức Giống Xử lí nhiệt Kích thƣớc mẫu 1 TQ - * 2 TL - * 3 LĐ - * 4 TQ + * 5 TL + * 6 LĐ + * 7 TQ - ** 8 TL - ** 9 LĐ - ** 10 TQ + ** 11 TL + ** 12 LĐ + ** Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt; (*): mẫu ĐST có kích thước từ 0,3 - 0,5 mm; (**): mẫu ĐST có kích thước từ 0,5 – 1mm. 32 Các chỉ tiêu theo dõi Thời gian tái sinh: được tính từ khi cấy ĐST đến khi lá đầu tiên của chồi tái sinh xuất hiện. Tỉ lệ sống: tỉ lệ giữa số ĐST tái sinh và số ĐST cấy ban đầu. Tỉ lệ này được ghi nhận 30 ngày sau khi cấy ĐST. Hệ số nhân chồi 70 ngày sau khi cấy. Hệ số nhân chồi = tổng số chồi đếm được/ tổng số mẫu cấy ban đầu. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), hai yếu tố, 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chồi tái sinh từ ĐST. Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST Nghiệm thức Giống Xử lí nhiệt 1 TQ - 2 TL - 3 LĐ - 4 TQ + 5 TL + 6 LĐ + Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt (+): xử lí nhiệt Các chỉ tiêu theo dõi Chiều cao chồi (cm): tính từ mặt thạch đến đầu lá dài nhất khi được vuốt thẳng. Số lá: tổng số lá của chồi Số rễ: tổng số rễ của chồi. 33 Chiều dài rễ (cm): tính theo chiều dài của rễ dài nhất. Các số liệu được ghi nhận sau 30, 50 và 70 ngày nuôi cấy. Xử lí số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphics 7.0 để xử lí số liệu. 3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng Cây dứa tái sinh từ ĐST ở Nội dung 1 được kiểm tra virus PMWaV-1 và PMWaV-2 bằng kĩ thuật RT-PCR. 3.4.1. Vật liệu Mẫu kiểm tra Mẫu lá của chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng. Thiết bị và dụng cụ Máy điện di Máy PCR Máy ly tâm Tủ lạnh -20 0 C, tủ mát 4 0 C Pipet, cối nghiền mẫu Hóa chất Kit tách chiết RNA: Arum Total RNA Mini Kit (Bio- rad). Primer chuyên biệt để nhận biết PMWaV-1 và PMWaV-2. Primer đặc trưng cho PMWaV-1 có trình tự như sau: 5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’ 5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’ Primer đặc trưng cho PMWaV-2 có trình tự như sau: 5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’ 5’-CCATCCACCAATTTTACTAC-3’ Access RT-PCR kit (Promega) Tris-Acetic acid-EDTA (TAE) 0,5X 3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành Ly trích RNA tổng số 34 Sử dụng qui trình ly trích RNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 2) để thu RNA tổng số. Dịch ly trích RNA được sử dụng trong các phản ứng RT-PCR. RNA của PMWaV (nếu có) sẽ được khuếch đại nhờ các primer đặc hiệu với đoạn gen HSP 70 của virus. Sản phẩm khuếch đại RT-PCR được thể hiện trên gel điện di. Nhuộm ethidium bromide và chụp hình gel bằng tia UV để đọc kết quả. Thực hiện RT-PCR Bƣớc 1: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Các hoá chất cần chuẩn bị như sau: Nuclease –free light mineral oil (Sigma Cat # M5904) Hỗn hợp phản ứng (reaction mix) Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT - PCR Thành phần mix RT - PCR Thể tích sử dụng Nuclease – Free water X l MMV/Tfl 5X ( ủ ở 65 0 C 15 phút trước khi pha) 10 l dNTP (*) 1 l Primer xuôi và ngược (**) 50 pmol/loại 25 nM MgSO 4 (*) 2 l AMV RT ( 5 u / l ) 2 l Tfl DNA polymerase ( 5 u / l ) 1 l Dịch ly trích RNA 2 l Thể tích cuối V = 50 l Ghi chú: (*) Vortex trước khi sử dụng (**) Primer đặc trưng cho HSP 70 của PMWaV-1,2 do IDT (Intergrated of DNA technologies, USA) cung cấp Pha mix trong tube 0,5 ml và trộn đều bằng pipet. Sau khi thêm AMV RT và Tfl DNA polymerase vào, vortex hỗn hợp trong 10 giây. Phủ lên mỗi tube 1- 2 giọt Nuclease – free mineral oil. Đặt tube vào bồn giữ nhiệt ủ ở 45 0 C trong 45 phút. Bƣớc 2 Thực hiện phản ứng RT- PCR 35 Cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước gồm quá trình tổng hợp cDNA và khuếch đại RNA. Chu kì nhiệt cho phản ứng Giai đoạn 1 (thực hiện phiên mã ngược) Tổng hợp sợi cDNA : 45 0 C/ 45 phút (1 chu kì); 94 0 C/2 phút (1 chu kì) Giai đoạn 2 (phản ứng PCR) cDNA được khuếch đại theo chương trình nhiệt sau: 92 0 C/30 giây, 58 0 C/1 phút, 68 0 C/90 giây (10 chu kì); 92 0 C/30 giây, 54 0 C/1 phút, 68 0 C/90 giây (35chu kì). 68 0 C/8 phút (1 chu kì). Điện di sản phẩm Chuẩn bị hỗn hợp điện di 5 l/ giếng (3,5 l mẫ + 1,5 l loading dye) Load hỗn hợp lên gel agarose 1,5% và chạy điện di trong 60 phút ở 50V cho đến khi vạch màu loading dye chạy đến 2/3 chiều dài gel. Buffer điện di là TAE 0,5X. Nhuộm Ethidium bromide 15 phút và chụp hình gel dưới tia UV và đọc kết quả. Mẫu kiểm tra Gồm 12 mẫu lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau: Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật RT-PCR Giống Xử lí nhiệt Số mẫu kiểm tra TQ - 1 TL - 1 LĐ - 1 TQ + 3 TL + 3 LĐ + 3 Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt. 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS 4.1.1 Thời gian tái sinh Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (TGTS) của ĐST chồi dứa Cayenne như sau: Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lý nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST chồi dứa Cayenne Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức TGTS trung bình (ngày) Giống TQ 1, 4, 7, 10 12,56 a TL 2, 5, 8, 11 12,78 a LĐ 3, 6, 9, 12 12,56 a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3, 7, 8, 9 12,50 a + 4, 5, 6, 10, 11, 12 12,76 a Kích thƣớc mẫu (mm) 0,3 – 0,5 1, 2, 3, 4, 5, 6 13,44 b 0,5 – 1 7, 8, 9, 10, 11, 12 11,81 a Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả Bảng 4.1 cho thấy sự khác biệt về thời gian tái sinh xét theo yếu tố giống và xử lí nhiệt là do sai số ngẫu nhiên (P 0,05). Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê do ảnh hưởng của kích thước mẫu (P 0,05). Các nghiệm thức với kích thước mẫu từ 0,3 – 0,5 mm có thời gian tái sinh trung bình là 13 ngày trong khi với kích thước mẫu từ 0,5 – 1 mm thời gian tái sinh trung bình là 11 ngày. Nhìn chung thời gian tái sinh là 12,62 ngày (xem Phụ lục). . hiện gồm 2 nội dung như sau: Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus bằng nuôi cấy ĐST và xử lí nhiệt. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV-1 và PMWaV-2 trên cây dứa in vitro nuôi cấy từ ĐST đã. như sau: Nhiệt đ : 24 + 2 0 C Thời gian chiếu sáng: 16 giờ ( từ 6 giờ – 21 giờ) Cường độ ánh sáng: 1000 – 2000 lux Ẩm đ : 55 % – 60% Xử lí nhiệt Cây dứa in vitro cao khoảng 4 – 5 cm được. điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 1/3 – 30/8/20 05 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro