47 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV ở chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy Giống Xử lí nhiệt Tỉ lệ chồi dứa nhiễm PMWaV (%) PMWaV-1 PMWaV-2 TQ - 100 0 TL - 100 0 LĐ - 100 0 TQ + 66,67 0 TL + 100 0 LĐ + 33,33 0 Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Bảng 4.8 cho thấy số chồi dứa tái sinh nhiễm PMWaV-1 khá cao trong khi 100% mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính với PMWaV- 2. Các ĐST tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc và Lâm Đồng không xử lí nhiệt vẫn còn nhiễm PMWaV-1. Nguyên nhân chồi tái sinh còn nhiễm virus có thể do mật độ virus trong chồi dứa in vitro ban đầu cao, phần mô phân sinh đỉnh sạch virus rất nhỏ và xác suất có được chồi dứa tái sinh sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy ĐST rất thấp. Phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST bước đầu cho thấy hiệu quả loại bỏ virus. Với phương pháp này 100% chồi dứa tái sinh thuộc giống Cayenne Thái Lan sạch PMWaV-1, ở giống Cayenne Trung Quốc tỉ lệ này rất thấp chỉ đạt 33,33% (66,67% nhiễm PMWaV-1) và giống Cayenne Lâm Đồng đạt 66,67%. Sự khác biệt này có thể do mức độ nhiễm PMWaV-1 của chồi dứa in vitro ban đầu và sự khác nhau về hiệu quả xử lí nhiệt ở từng giống. Ngoài ra, kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến hiệu quả loại bỏ virus. Kích thước mẫu càng lớn thì khả năng nhận được cây sạch virus càng thấp. Tuy nhiên, từ kết quả trên chưa đánh giá được hiệu quả của các phương pháp tạo cây sạch virus áp dụng trong đề tài trong việc loại bỏ PMWaV-2 do 100% mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính với PMWaV-2. 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu được có thể đưa ra một số kết luận sau: Sự tái sinh của ĐST nuôi cấy Thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi của ĐST nuôi cấy chủ yếu do kích thước mẫu chi phối. Mẫu cấy kích thước từ 0,3 – 0,5 mm có thời gian tái sinh trung bình, tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi thấp hơn so với mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm. Sự tương tác giữa yếu tố xử lí nhiệt và kích thước mẫu ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi và ảnh hưởng này thay đổi tùy theo giống. Tuy nhiên, việc xử lí nhiệt ở 37 0 C trong 30 ngày ảnh hưởng không đáng kể đến sự tái sinh của ĐST chồi dứa Cayenne in vitro. Sự sinh trƣởng của ĐST nuôi cấy Kết quả về các chỉ tiêu sinh trưởng của chồi dứa tái sinh cho thấy chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ chủ yếu do yếu tố giống quyết định. Chồi tái sinh từ ĐST thuộc giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan sinh trưởng tốt hơn giống Cayenne Lâm Đồng trong điều kiện thí nghiệm. Sự tương tác giữa hai yếu tố giống và xử lí nhiệt ảnh hưởng nhất định đến sự tăng trưởng chiều cao và chiều dài rễ của chồi dứa tái sinh của cả ba giống dứa Cayenne. Ở chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc có xử lí nhiệt thì chiều cao trung bình và chiều dài rễ lớn hơn so với chồi tái sinh cùng giống không xử lí nhiệt; ở chồi dứa Cayenne Thái Lan tái sinh được xử lí nhiệt thì sự tăng trưởng chiều cao và chiều dài rễ giảm đi so với chồi tái sinh cùng giống không xử lí nhiệt và chồi dứa thuộc giống Cayenne Lâm Đồng không bị ảnh hưởng bởi việc xử lí nhiệt. Từ các kết quả có được, có thể thấy việc xử lí nhiệt nhìn chung ảnh hưởng không đáng kể đến sự sinh trưởng của chồi tái sinh. 49 Kiểm tra PMWaV ở chồi tái sinh Thực tế cho thấy bằng phương pháp nuôi cấy ĐST đơn thuần không thể loại bỏ PMWaV-1 nhưng có thể tạo được chồi dứa sạch PMWaV-1 với tỉ lệ thấp 66,67% (6/9) bằng cách kết hợp nuôi cấy ĐST và xử lí nhiệt ở 37 0 C trong 30 ngày. Việc xử lí nhiệt bước đầu thể hiện hiệu quả bất hoạt và loại bỏ PMWaV-1và làm tăng khả năng sạch virus của ĐST nuôi cấy. Trong khi đó, có thể tạo chồi dứa hoàn toàn sạch PMWaV-2 bằng phương pháp nuôi cấy ĐST và phương pháp kết hợp xử lí nhiệt - nuôi cấy ĐST. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu thêm về vấn đề này để có kết luận chính xác hơn. 5.2. Đề nghị Để có thể áp dụng đề tài vào thực tiễn, chúng tôi xin đề nghị một số nghiên cứu tiếp theo để hoàn thiện phương pháp tạo cây sạch virus này: - Cần nghiên cứu sự liên quan giữa kích thước mẫu ĐST nuôi cấy và khả năng sạch virus của mẫu. - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nhiệt độ cao hơn (38 0 C – 40 0 C) và thời gian xử lí nhiệt khác nhau lên sự sinh trưởng của chồi tái sinh. - Nghiên cứu tối ưu hóa qui trình xử lí nhiệt nhằm làm tăng diện tích vùng “sạch virus” ở mô phân sinh ngọn. Từ đó có thể tăng kích thước mẫu ĐST nuôi cấy, tăng khả năng tái sinh của ĐST mà vẫn đảm bảo “sạch virus”. - Tiếp tục nghiên cứu hiệu quả loại bỏ PMWaV của phương pháp nuôi cấy ĐST và nuôi cấy ĐST kết hợp xử lí nhiệt. - Áp dụng những kết quả của các đề tài nghiên cứu trước về nuôi cấy mô cây dứa Cayenne, sử dụng môi trường có chất kích thích tăng trưởng để rút ngắn thời gian tái sinh của ĐST nuôi cấy và nhân nhanh các chồi có kết quả kiểm tra PMWaV (-). - Không sử dụng các chồi in vitro có kết quả kiểm tra PMWaV (+) với mục đích kinh doanh hay sản xuất. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn, Ngân hàng phát triển Châu Á và Viện nghiên cứu cây ăn quả miền Nam, 2003. Sổ tay kĩ thuật trồng và chăm sóc một số cây ăn quả miền Trung và miền Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, tr 46-59. 2. Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Nguyễn Thái Quỳnh Như, 2005. Điều tra tình hình bệnh hại trên cây dứa ở Tp. HCM và xác định tác nhân gây bệnh đỏ đầu lá dứa bằng phương pháp RT-PCR. Khóa luận tốt nghiệp khoa Nông Học, trường Đại học Nông Lâm, Tp. HCM. 4. Nguyễn Văn Kế, 2001. Cây ăn quả nhiệt đới Quyển 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp.HCM. 5. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Tp. HCM. 6. Phạm Văn Khánh, 2004. Điều tra bệnh trên dứa (Ananas comosus (L.) Merr) ở Đức Trọng, Lâm Đồng và nông trường Thọ Vực, Xuân Lộc, Đồng Nai. Khóa luận tốt nghiệp khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm, Tp. HCM. 7. Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2000. Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 8. Võ Thị Mỹ Hân, 2004. Điều tra bệnh hại trên cây dứa (Ananas comosus) ở huyện Tân Phước tỉnh Tiền Giang. Khóa luận tốt nghiệp khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm, Tp. HCM. 9. Võ Thị Thúy Huệ, 2004. Điều tra bệnh hại cây dứa (Ananas comosus L.) ở Bến Lức tỉnh Long An và huyện Bình Chánh Tp. HCM. Khóa luận tốt nghiệp khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm, Tp. HCM. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 10. Hughes, G., and Samita, S., 1998. Analysis of patterns of pineapple mealybug wilt disease in Srilanka. Plant Disease, 82: 885 – 890. 11. Hu, J. S., Sether, D. M., Liu, X. P., Wang, M., Zee, F., and Ulman, D. E., 1997. Use of a tissue blotting immunoassay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii. Plant Disease, 81:1150-1154. 12. Sambrook J., and Russell D. W., 2001. Molecular cloning, vol. 2. 3 rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. 13. Rohrbach K. G., Beardsley J. W., German T. L., Reimer N. J., and Sanford W. G., 1988. Mealybug wilt, Mealybugs and Ants on Pineapple. Plant Disease. 72 (7). 51 14. Melzer, M. J., Karasev, A. V., Sether, D. M., and Hu, J. S., 2001. Nucleotide sequence, genome organization and phylogenetic analysis of pineapple mealybug wilt-associated virus-2. Journal of General Virology, 82: 1-7. 15. Pierik, R.L.M., 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers. 16. Sether, D. M., Ulman, D. E., and Hu, J. S., 1998. Transmission of pineapple mealybug wilt-associated virus by two species of mealbug (Dysmicoccus spp.). Phytopathology, 88:1224-1230. 17. Sether, D. M., Karasev A. V., Okumura C., Arakawa C., Zee F., Kislan M. M., Busto J. L., and Hu J. S., 2001. Differentiation, distribution, and elimination of two different pineappple mealybug wilt-associated viruses found in pineapple. Plant Disease 85 (8): 856-864. 18. Sether, D. M., and Hu, J. S., 2002. Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of pineapple disease. Phytopathology, 92: 928-935. 19. Sether, D. M., and Hu, J. S., 2002. Yield impact and spread of Pineapple mealybug wilt associated virus-2 and mealybug wilt of pineapple in Hawaii. Plant Disease. 86:867-874. 20. Sipes, B. S., Sether D. M., and Hu J. S., 2002. Interactions between Rotylenchus reniformis and Pineapple mealybug wilt associated virus-1 in pineapple. Plant Disease. 86:933-938 21. Webster Craig G., Wylie Stephen J., and Jones Michael G. K., 2004. Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science, vol. 86, No.12:1604-1607. TÀI LIỆU TỪ INTERNET 22. http://www.apsnet.org/online/feature/pineapple/ 23. Hu J. S., Sether D. M., Ullman D. E. and Lockhart B.E Mealybug wilt of pineapple: pineapple viruses & two step heat treatment of pineapple crowns. ISHS Acta Horticulturae 425: Second International Pineapple Symposium. www.actahort.org/books/425/425_52.htm. 16/06/2005 24. Ullman D.E., Williams D.F., Fleisch H., Hu J.S., Sether D.M. and Gonsalves A Heat treatment of pineapple: subsequent growth and occurrence of mealybug wilt of pineapple. ISHS Acta Horticulturae 334: First International pineapple symposium. www.actahort.org/books/334/334_43.htm. 16/06/2005 25. http://www.agroviet.gov.vn/loadasp/tn/tn-spec-nodate-detail.asp?tn=tn&id=998127. 12/03/2005 26. Hort 30 Pineapple. http://www.hort.purdue.edu/newcrop/tropical/lecture_30/lec_30.html. 05/05/05 52 27. http://www.mard.gov.vn/fsiu/data/trongtrot1.htm 28. http://www.apsnet.org/online/common/names/pineappl.asp 29. http://vnexpress.net/Vietnam/Khoa-hoc/2005/04/3B9DD14D/. 15/06/2005 30. http://www.vnn.vn/service/printversion?article_id=603246. 15/06/2005 31. http://www.agroviet.gov.vn/loadasp/tn/tn-spec-nodate-detail.asp?tn=tn&id=998128. 17/06/2005 32. http://www.gialai.gov.vn/default.asp?t=gt_dinhhuong.htm 17/06/2005 33. http://www.hort.purdue.edu/newcrop/tropical/lecture_32/lec_32.html 34. www.bayceer.uni-bayreuth.de/bayceer/de/pub/pub/pub_detail.php?id_obj=22424. 15/6/2005 35. http://en.wikipedia.org/wiki/Pineapple 36. http://trc.ucdavis.edu/egsutter/plb171/lecturespdf4/14-Virus%20elimination.pdf 37. http://www.ansinet.org/fulltext/jbs/jbs110898-899.pdf.10 23/2/05) 38. http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(4).htm. 09/08/2005. 39. Applications of Tissue culture to Plant Improvement TissueCultureLecture[1] (tl dạng Powerpoint) PHỤ LỤC 1 Thành phần môi trƣờng khoáng cơ bản (MS) dùng trong thí nghiệm nuôi cấy dứa Cayenne Nguyên tố Nồng độ (mg/l) Nguyên tố đa lƣợng CaCl 2 332,02 KNO 3 1900,00 KH 2 PO 4 170,00 NH 4 NO 3 1650,00 MgSO 4 .7H 2 O 180,54 Nguyên tố vi lƣợng CoCl 2 .6H 2 O 0,025 CuSO 4 .5H 2 O 0,025 H 3 BO 3 6,20 KI 0,83 MnSO 4 .H 2 O 16,90 Na 2 MoO 4 .H 2 O 0,25 ZnSO 4 .H 2 O 8,60 Vitamine & aminoacid Glycine 2,00 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10 FeNaEDTA 36,70 PHỤ LỤC 2 QUI TRÌNH LY TRÍCH RNA TỔNG SỐ 1. Nghiền mẫu trong nitơ lỏng 2. Chuyển 60 mg mẫu (đã nghiền) vào tube ly tâm 2,0 ml có nắp đậy không chứa RNase. 3. Thêm 700 l Lysis Solution và 14 l PVP 2% (w/v) vào tube ở bước 2. Đồng nhất mẫu bằng pipet (30-60 giây). 4. Ly tâm 3 phút với vận tốc 12000 vòng ở 4 0 C; chuyển dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy mới. 5. Thêm 700 l ethanol 70%. 6. Ủ Elution Solution ở 70 0 C (chuẩn bị cho bước 15). Đặt cột RNA (RNAbc) vào tube 2ml không nắp. 7. Cho 700 l dung dịch ở bước 5 vào RNAbc. Ly tâm với vận tốc 12000 vòng/phút ở 4 0 C trong 60 giây. Loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho phần dung dịch còn lại. 8. Pha dịch rửa Low Stringency 1X từ dung dịch 5X ban đầu với ethanol 95-100%. 9. Cho 700 l dung dịch Low Stringency vào RNAbc. Ly tâm 30 giây sau đó loại bỏ dịch lọc. 10. Pha DNase I với 250 l 10mM Tris pH 7.5 11. Trộn 5 l DNase I với 75 l dung dịch Dnase delution (trong tube 1,5 ml) rồi cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc. 12. Cho 700 l dung dịch High stringency vào RNAbc. Ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc. 13. Thực hiện như bước 12 với dung dịch Low Stringency. 14. Ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. 15. Chuyển RNAbc vào tube 1,5 ml có nắp, thêm vào 80 l dung dịch hòa tan ở bƣớc 6 và để yên trong 1 phút. Ly tâm 2 phút để thu RNA tổng số. Dịch ly trích được bảo quản ở 4 0 C cho đến khi sử dụng. PHỤ LỤC 3 1.Thời gian tái sinh Analysis of Variance for TGTAIS1.tgian__nga - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level MAIN EFFECTS A:TGTAIS1.giong 1.185185 2 .592593 .300 .7412 B:TGTAIS1.xln 1.814815 1 1.814815 .920 .3501 C:TGTAIS1.kt_mau 71.703704 1 71.703704 36.357 .0000 INTERACTIONS AB 14.296296 2 7.1481481 3.624 .0304 AC 15.407407 2 7.7037037 3.906 .0234 BC .037037 1 .0370370 .019 .8927 ABC 1.407407 2 .7037037 .357 .7008 RESIDUAL 189.33333 96 1.9722222 TOTAL (CORRECTED) 295.18519 107 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for TGTAIS1.tgian__ngay 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean GRAND MEAN 108 12.629630 .1351344 12.361330 12.897930 A:TGTAIS1.giong 1 36 12.555556 .2340597 12.090846 13.020265 2 36 12.777778 .2340597 12.313069 13.242487 3 36 12.555556 .2340597 12.090846 13.020265 B:TGTAIS1.xln 0 54 12.500000 .1911090 12.120567 12.879433 1 54 12.759259 .1911090 12.379826 13.138693 C:TGTAIS1.kt_mau 1 54 13.444444 .1911090 13.065011 13.823878 2 54 11.814815 .1911090 11.435381 12.194248 AB 1 0 18 12.388889 .3310104 11.731691 13.046087 1 1 18 12.722222 .3310104 12.065024 13.379420 2 0 18 13.111111 .3310104 12.453913 13.768309 2 1 18 12.444444 .3310104 11.787247 13.101642 3 0 18 12.000000 .3310104 11.342802 12.657198 3 1 18 13.111111 .3310104 12.453913 13.768309 AC 1 1 18 13.888889 .3310104 13.231691 14.546087 1 2 18 11.222222 .3310104 10.565024 11.879420 2 1 18 13.222222 .3310104 12.565024 13.879420 2 2 18 12.333333 .3310104 11.676135 12.990531 3 1 18 13.222222 .3310104 12.565024 13.879420 3 2 18 11.888889 .3310104 11.231691 12.546087 BC 0 1 27 13.333333 .2702689 12.796734 13.869933 0 2 27 11.666667 .2702689 11.130067 12.203266 1 1 27 13.555556 .2702689 13.018956 14.092155 1 2 27 11.962963 .2702689 11.426363 12.499563 Multiple range analysis for TGTAIS1.tgian__nga by TGTAIS1.giong Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 1 36 12.555556 X 3 36 12.555556 X 2 36 12.777778 X contrast difference limits 1 - 2 -0.22222 0.65720 1 - 3 0.00000 0.65720 2 - 3 0.22222 0.65720 * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for TGTAIS1.tgian__nga by TGTAIS1.xln Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 0 54 12.500000 X 1 54 12.759259 X contrast difference limits 0 - 1 -0.25926 0.53660 * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for TGTAIS1.tgian__nga by TGTAIS1.kt_mau Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 2 54 11.814815 X 1 54 13.444444 X contrast difference limits 1 - 2 1.62963 0.53660 * denotes a statistically significant difference. Thời gian tái sinh trung bình của các nghiệm thức Nghiệm thức Giống Xử lí nhiệt Kích thước mẫu TGTS TB (ngày) 1 TQ - * 13.89 2 TL - * 13.44 3 LĐ - * 12.67 4 TQ + * 13.89 5 TL + * 13.00 6 LĐ + * 13.78 7 TQ - ** 10.89 8 TL - ** 12.78 9 LĐ - ** 11.33 10 TQ + ** 11.56 11 TL + ** 11.89 12 LĐ + ** 12.44 . .300 .74 12 B:TGTAIS1.xln 1.814815 1 1.814815 .920 .3501 C:TGTAIS1.kt_mau 71 .70 370 4 1 71 .70 370 4 36.3 57 .0000 INTERACTIONS AB 14.296296 2 7. 1481481 3.624 .0304 AC 15.4 074 07 2 7. 70 370 37 3.906. and spread of Pineapple mealybug wilt associated virus- 2 and mealybug wilt of pineapple in Hawaii. Plant Disease. 8 6:8 67- 874 . 20. Sipes, B. S., Sether D. M., and Hu J. S., 2002. Interactions. 7. 70 370 37 3.906 .0234 BC .0 370 37 1 .0 370 370 .019 .89 27 ABC 1.4 074 07 2 .70 370 37 .3 57 .70 08 RESIDUAL 189.33333 96 1. 972 2222 TOTAL (CORRECTED) 295.18519 1 07 0 missing values have been excluded.