i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Th.S NGUYỄN THÁI THỦY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, nhận xét và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Thái Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều, cũng như đã cho em những lời khuyên quý giá để hoàn thành khóa luận. Em xin gửi đến thầy lời biết ơn chân thành nhất. Thầy Phương, chị Kim Anh, anh Luân (công ty Bio-Rad) đã giúp đỡ em thực hành và nắm vững phương pháp Real-Time PCR. Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Bùi Văn Lệ, anh Vũ, chị Liên, anh Nam cùng với các anh chị và các bạn đang làm việc tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn và dành cho em những tình cảm quý giá trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Con xin gửi lòng tri ân đến Ba, Mẹ, em Thành và những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất. Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học K27 đã cùng tôi chia sẻ biết bao buồn vui cũng như đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt những năm tháng dưới mái trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Xin chân thành cảm ơn bạn Khánh Đan đã luôn động viên, giúp đỡ và dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất. Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người Sinh viên Nguyễn Hữu Trưởng iv TÓM TẮT Nguyễn Hữu Trƣởng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn và Th.S Nguyễn Thái Thủy. Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp Hồ Chí Minh và phụ cận. Đề tài đã có những kết quả sau: Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen: - Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Quy trình đề nghị: dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein: phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol. - Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I. Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC. - Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman. Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước. - Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau. v SUMMARY NGUYEN HUU TRUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, VietNam. Aug 2005. ESTABLISHING A PROCESS OF GMOs (Genetically Modified Organisms) QUANTIFICATION BY REAL-TIME PCR METHOD Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy. Recently, GMO is a controversial problem in the world. Because its advantages and disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and human health. For this purpose, methods for GMOs detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO presentation in food and feed need to be developed. So, in this thesis, a process for GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one of the most exactly methods for GMO quantification now. Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S promoter by Real-Time PCR method. Evaluating quantification ability and efficiency of method. Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in Ho Chi Minh City. Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method: - Step 1: DNA extraction: Cell wall destruction solution: CTAB 2%. Protein denaturalization solution: phenol/chloroform. DNA precipitation solution: Isopropanol - Step 2: GM maize screening based on 35S promoter. Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye. Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86- 86,5 o C). - Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter. Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman. Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a experiment template, exactly quantification a template which percentage ratio of GMO presentation has known. - Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO in its ingredients. Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been established and can be applied to many other species. vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC vi CHỮ VIẾT TẮT xi DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xiv PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 1.Đặt vấn đề 1 2.Mục đích và yêu cầu 2 2.1.Mục đích 2 2.2.Yêu cầu 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) 3 2. Quá trình tạo sinh vật GMO 3 2.1.Quá trình cơ bản 3 2.2.Promoter CaMV 35S 4 3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen 6 3.1.Ứng dụng 6 3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] 6 3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17] 7 3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen 8 4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới 9 4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới 11 5.Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 12 5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] 12 5.2.Tác động có hại 12 5.2.1. Môi trường 13 5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng 13 5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể 14 vii 5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 14 6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 16 6.1.Quy định tại châu Âu [33]: 17 6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA 18 6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu 19 6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19 6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen 19 7. Tình hình Việt Nam 21 7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen 21 7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen 21 8. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen 22 8.1.Phương pháp ELISA 23 8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] 23 8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR 24 8.3.1. Hóa chất định lượng 24 8.3.1.1. SYBR Green I 25 8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) 25 8.3.2. Công cụ phát hiện 27 8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR 28 8.4.1. Quan hệ định lượng 28 8.4.2. Thiết kế thí nghiệm 29 8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR 30 8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO 31 8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen [9][44]32 8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên promoter 35S. 34 8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. 34 8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S 35 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36 1.Nội dung nghiên cứu 36 2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm 36 viii 2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm 36 2.2.Thời gian thực hiện 36 3.Tiến trình thí nghiệm: 36 4.Vật liệu thí nghiệm 37 5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA 38 5.1.Mục tiêu 38 5.2.Vật liệu 38 5.3.Phương pháp thực hiện 38 5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích 41 6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 41 6.1.Mục tiêu 41 6.2.Nguyên tắc 41 6.3.Vật liệu thí nghiệm 42 6.4.Trang thiết bị 42 6.5.Phương pháp thực hiện 43 6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR 43 6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 43 6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại 44 6.5.4. Phân tích kết quả 45 7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen 46 7.1.Mục tiêu 46 7.2.Nguyên tắc 46 7.3.Vật liệu thí nghiệm 46 7.4.Trang thiết bị 46 7.5.Phương pháp thực hiện 46 7.5.1. Bố trí thí nghiệm 46 7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47 7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng 48 7.5.2. Thành phần phản ứng PCR 48 7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix 49 7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix 49 7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 49 ix 7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển 50 7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm 51 8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR. 54 8.1.Mục tiêu 54 8.2.Nguyên tắc 54 8.3.Vật liệu thí nghiệm 54 8.4.Trang thiết bị 54 8.5.Hóa chất 54 8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix 55 8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference calibration DNA standards) 55 8.6.Phương pháp thực hiện 55 8.6.1. Bố trí thí nghiệm 56 8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng 56 8.6.1.2. Độ chính xác: 56 8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng 56 8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR 57 8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 57 8.6.5. Phân tích kết quả 58 9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng 58 9.1.Mục tiêu 58 9.2.Nguyên tắc 58 9.3.Vật liệu thí nghiệm 58 9.4.Trang thiết bị và hóa chất 58 9.5.Phương pháp thực hiện 59 9.5.1. Bố trí thí nghiệm 59 9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng 59 9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập 59 9.5.4. Phân tích kết quả 59 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 x 1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA 60 2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 63 2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống 63 2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green 65 3.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO 71 3.1.Xây dựng đường chuẩn: 71 3.2.Đánh giá kết quả định lượng 74 4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR 76 4.1.Độ nhạy của phương pháp: 76 4.2.Độ chính xác của phương pháp 78 5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85 1.Kết luận 85 2.Đề nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 92 [...]... 4 Hình 2. 2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46] 5 Hình 2. 3: Trình tự vùng promoter 35S [16 ] 5 Hình 2. 4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17 ] 9 Hình 2. 5: Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu [20] 10 Hình 2. 6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18 ] 10 Hình 2. 7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19 ] 11 Hình 2. 8: Biểu tình phản đối... Âu [27] 15 Hình 2. 9: Không yêu cầu dán nhãn [42] 19 Hình 2 .1 0: Bắt buộc phải dán nhãn [42] 19 Hình 2 .1 1: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13 ] 20 Hình 2 .12 : QC -PCR 23 Hình 2 .1 3: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] 25 Hình 2 .1 4: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43] 26 Hình 2 .1 5: Máy Real-Time PCR [8] 27 Hình 2 .1 6: Cấu tạo bộ phận... Hình 4 .1 1: Đồ thị Melt curve của phương pháp SYBR Green I ở thí nghiệm 3 75 Hình 4 .1 2: ồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy 76 Hình 4 .1 3: Đồ thị định lượng p35S của các mẫu thí nghiệm 78 Hình 4 .1 4: Đường chuẩn phản ứng định lượng p35S 79 Hình 4 .1 5: Đồ thị định lượng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm 79 Hình 4 .1 6: Đường chuẩn phản ứng định lượng gen tham chiếu 79 xiii ... phận quang học của máy Real-Time PCR [14 ] 28 Hình 2 .1 7: Đường chuẩn cho phản ứng định lượng [14 ] 30 Hình 2 .1 8: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14 ] 31 Hình 2 .1 9: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMO [44] 34 Hình 3. 1: Màn hình Melt Curve 45 Hình 3. 2: Màn hình Edit Protocol 50 Hình 3. 3: Màn hình Edit Plate Setup 51 Hình 3. 4: Màn hình View Quantities/Identifiers... N/A: Not available NTC: No template control OD: Optical density PCR : Polymerase chain reaction QC -PCR : Quantitative competitive PCR RNA: Ribonucleic acid SD: Standard Deviation SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris,Acetic acid, EDTA Taq : Thermus aquaticus Tm : Melting Temperature Tnos: Terminator nopaline synthetase U: Unit UV: Ultra violet xi DANH MỤC HÌNH TRANG Hình 2. 1: Quy trình chuyển gen [17 ]... 65 Hình 4. 5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm 66 Hình 4. 6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng 67 Hình 4. 7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm 67 Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp 71 Hình 4. 9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S 72 xii Hình 4 .1 0: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phương pháp 1 73 Hình 4 .1 1: Đồ thị Melt... Quantities/Identifiers 51 Hình 3. 5: Màn hình View Post-Run Data 52 Hình 3. 6: Màn hình PCR Quantification 53 Hình 3. 7: Màn hình PCR Standard Curve 53 Hình 4. 1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích 60 Hình 4. 2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm 61 Hình 4. 3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phương pháp 1 64 Hình 4. 4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng... TẮT 35S: 35S promoter Bp: Base pair Bt: Bacillus thringensis CaMV: Cauliflower mosaic virus CCD: Charged coupled device CT : Threshold cycle CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates EC: European Community ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay FAO: Food and Agriculture Organization GMOs: Genetically modified organisms GMP: Genetically . DNA 18 6 .1. 2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu 19 6 .1. 2 .1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19 6 .1. 2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen 19 7. Tình hình. 5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 14 6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 16 6 .1 .Quy định tại châu Âu [33 ]: 17 6 .1. 1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA 18 6 .1. 2 tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của phương pháp. Định lượng một số