26 thường không gây trở ngại cho việc khuếch đại DNA. Có nhiều cách khác nhau, tuy nhiên ta sẽ tìm hiểu một phương pháp khá đơn giản. Đó là mẫu dò Taqman. Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43] Phương pháp Taqman dựa trên khả năng 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA Polymerase để cắt đứt một mẫu dò trong phản ứng PCR. Taqman thông thường là một chuỗi oligonucleotide dài khoảng 20-30 base (thường nó có nhiệt độ nóng chảy cao hơn 10 o C so với nhiệt độ nóng chảy của mồi) có gắn thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở đầu 5‟ và một thuốc nhuộm hấp thu ở đầu 3‟. Do đầu 3‟ bị khóa, mẫu dò không thể được kéo dài như một mồi. Trong phản ứng PCR, với sự hiện diện của gen đích, mẫu dò liên kết đặc hiệu ở giữa hai mồi xuôi và ngược. Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, thuốc nhuộm hấp thu ở gần thuốc nhuộm phát huỳnh quang làm cho tín hiệu huỳnh quang bị triệt tiêu chủ yếu do hiệu ứng chuyển năng lượng kiểu Forster. Khi phản ứng PCR xảy ra, hoạt động 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA Polymerase sẽ phá hủy trình tự mẫu dò khi và chỉ khi mẫu dò này liên kết với gen đích. Lúc này, thuốc nhuộm phát huỳnh quang sẽ cách xa thuốc nhuộm hấp thu và chúng sẽ phát quang. Vì vậy, lượng DNA được tích lũy sẽ được phát hiện qua sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Quá trình này xảy ra trong mỗi chu kỳ và không gây cản trở việc khuếch đại DNA. Trong phương pháp này, mẫu dò Taqman phóng thích chất phát quang cộng thêm vào chất phát quang đã được phóng thích trong các chu kỳ trước đó. Vì vậy lượng tín hiệu huỳnh quang gia tăng rất nhiều sau mỗi chu kỳ. Phương pháp này sử dụng các chương 27 trình nhiệt của một phản ứng PCR bình thường. Một yêu cầu đặc biệt đối với mẫu dò là nó không được có base G ở đầu 5‟. Vì base G có thể triệt tiêu thuốc nhuộm phát huỳnh quang ngay cả khi mẫu dò đã bị phá hủy [42]. Công cụ phát hiện Việc phát hiện sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang để định lượng DNA đòi hỏi các công cụ khá phức tạp. Có nhiều công ty trên thế giới đã phát triển các loại phương pháp phục vụ cho việc này. Trong khóa luận này, chúng tôi sẽ mô tả sơ lược về nguyên lý và nguyên tắc hoạt động của máy My iQ TM Single Color Real-Time PCR Detection System của công ty Bio-Rad. Đây là công cụ chính của khóa luận này và nguyên tắc hoạt động của nó cũng tương đồng với khá nhiều hệ máy trên thế giới. Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] Máy My iQ TM bao gồm hai phần: - Máy luân nhiệt: Nằm phía dưới, có tác dụng như một máy PCR bình thường, có 96 giếng thí nghiệm. - Bộ phận quang học: Nằm phía trên, công dụng định lượng DNA. Bộ phận quang học của máy chứa hệ thống kích thích và hệ thống phát hiện. Hệ thống kích thích là một đèn halogen tungsten 50W, được làm mát bằng quạt; một bộ lọc nhiệt (kính hấp thụ tia hồng ngoại), một kính lọc ánh sáng kích thích có màn chớp, và một hệ thống 2 tấm kính cho phép rọi sáng đồng thời bản chứa mẫu. Hệ thống kích thích được đặt ở góc phải phía trước của bộ phận quang học, với chiếc đèn chiếu sáng từ phải sang trái, vuông góc với trục máy. Ánh sáng bắt nguồn từ chiếc đèn, qua bộ lọc nhiệt và kính lọc kích thích (nếu mở) và phản chiếu lên 96 giếng trong máy luân nhiệt 28 bằng một hệ thống các tấm kính. Ánh sáng này sẽ kích thích các phân tử huỳnh quang trong giếng [14]. Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] Hệ thống phát hiện chiếm 2 phần 3 phía sau bộ phận quang học. Các phần chính trong hệ thống phát hiện này bao gồm 1 kính lọc quang học đơn cho tín hiệu huỳnh quang phát ra và một đầu đọc CCD (charged coupled device). Đầu đọc này có độ phân giải 350.000 pixel cho phép định lượng riêng biệt tín hiệu huỳnh quang ở mỗi giếng. Ánh sáng huỳnh quang phát ra từ giếng thí nghiệm sẽ đi qua tấm kính lọc và được phát hiện bằng đầu đọc CCD [14]. Nguyên tắc định lƣợng bằng kĩ thuật Real-time PCR Quan hệ định lƣợng Hàm lượng GMO trong một mẫu thực phẩm được biểu diễn bằng lượng thành phần biến đổi gen trong tổng lượng thành phần. Để xác định giá trị này, ta cần đo lường số lượng trình tự một gen đối chiếu cũng như số lượng trình tự đặc trưng cho GMO. Gen đối chiếu được lựa chọn phải: - Đặc trưng cho loài - Hiện diện với số lượng một copy trong bộ gen đơn bội - Hiện diện ổn định trong các giống khác nhau của cùng một loài 29 - Nó có thể được khuếch đại trong phản ứng tương đương với tính trạng biến đổi gen (mặc dù điều này phụ thuộc nhiều vào việc thiết kế primer và probe). Một vấn đề nữa trong việc định lượng mà ta cần chú ý. Đó là, hàm lượng GMO (phần trăm) có thể được hiểu là trọng lượng của thành phần biến đổi gen trên tổng trọng lượng thành phần đó (ví dụ: trọng lượng bắp biến đổi gen trên tổng trọng lượng bắp trong mẫu thí nghiệm). Vì vậy, ta có thể tính toán phần trăm GMO bằng số lượng trình tự DNA biến đổi gen trên số lượng trình tự gen đối chiếu. Tuy nhiên, cây trồng biến đổi gen có một số khác biệt quan trọng, đó là: - Mức độ bội thể của giống: Có khả năng các giống cây trồng biến đổi gen có độ bội thể khác với giống thông thường (ví dụ: tứ bội thay vì đơn bội) - Mức độ dị hợp của giống: Tính trạng biến đổi gen có thể là đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. - Số lượng bản sao gen đơn bội của một cấu trúc nhân tạo. Gen có thể được chèn thành một bản sao trên bộ gen đơn bội hay thành nhiều bản sao. Vấn đề 3 có thể khắc phục bằng cách thiết kế hệ thống primer và probe trên đường biên giữa gen chuyển nạp và trình tự bộ gen. Trình tự đường biên độc nhất giúp ta có hai lợi thế, đó là phản ứng đặc hiệu và loại trừ việc chèn nhiều bản sao của cùng một cấu trúc có thể gây sai lệch kết quả định lượng. Vấn đề 1 và 2 có thể khắc phục dựa trên kinh nghiệm sử dụng những vật liệu đối chiếu tương đồng với mẫu thí nghiệm (ví dụ: sử dụng mẫu đối chiếu là bột bắp để định lượng bột bắp). Mặc khác, việc định lượng những mẫu chuẩn (trình tự DNA dòng hóa, hỗn hợp DNA ) khác các mẫu đối chiếu được cấp phép có thể giúp chỉnh lý những điểm không nhất quán trong định lượng. Một cách khác được chấp nhận rộng rãi để giải quyết vấn đề 1 và 2 đó là biểu thị phần trăm GMO trên bộ gen đơn bội [42]. Thiết kế thí nghiệm Một thí nghiệm Real-time PCR được thiết kế như sau: - Một phản ứng PCR dùng phát hiện và định lượng gen đích (trình tự DNA đặc trưng cho GMO). 30 - Phản ứng PCR thứ hai được thiết kế để phát hiện và định lượng trình tự một gen đối chiếu, đặc trưng cho loài và thường sử dụng cho định lượng GMO. - Đường chuẩn cho gen đích và gen đối chiếu. Trong mỗi thí nghiệm, lượng gen đích và gen đối chiếu được xác định từ đường chuẩn này. Sau đó, lượng gen đích được chia cho lượng gen đối chiếu để xác định phần trăm hiện diện của GMO trong mẫu. Để đạt yêu cầu thống kê, đường chuẩn phải có từ 3 - 4 nồng độ khác nhau. Hình 2.17: Đƣờng chuẩn cho phản ứng định lƣợng [14] Thêm vào đó, một đối chứng âm (NTC - no template control) cần được thêm vào trong mỗi thí nghiệm. Những đối chứng khác cũng có thể được sử dụng. Cuối cùng, thí nghiệm định lượng gen đối chiếu và gen đích phải được thực hiện trong cùng một lần chạy phản ứng PCR, điều này nhằm tránh những sai lệch thống kê giữa các thí nghiệm [42]. Phân tích dữ liệu Real-time PCR Khi phản ứng Real-time PCR hoạt động, tín hiệu huỳnh quang (Rn value) được thu nhận để tạo ra một đồ thị các tín hiệu tương ứng với số chu kỳ (trong cùng thời gian). Thông thường, đồ thị này có dạng bán-logarit, gồm 3 giai đoạn: Đầu tiên là pha “lag” với những dao động nhỏ tương ứng với tín hiệu nền, giai đoạn hai là hàm mũ với các đường biểu đồ song song, cuối cùng là giai đoạn bão hòa . Khả năng của phản ứng Real-time PCR là nó cho phép định lượng ngay trong giai đoạn DNA khuếch đại gia tăng theo hàm mũ, mà không ở giai đoạn cuối cùng khi lượng DNA bão hòa. Điều này nâng cao độ chính xác của việc định lượng do có sự 31 tương quan trực tiếp giữa lượng DNA ban đầu và giai đoạn mà tại đó toàn bộ DNA được nhân đôi sau mỗi chu kỳ. Hình 2.18: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14] Trong phản ứng Real-time PCR, chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, C T ) được định nghĩa là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang có giá trị cao hơn đáng kể so với tín hiệu nền nhưng vẫn nằm trong giai đoạn log tuyến tính. Thông thường đó là giá trị trung bình của các tín hiệu huỳnh quang từ chu kỳ 3 đến 15 cộng với 10 độ lệch chuẩn. Lượng DNA ban đầu càng nhiều thì lượng DNA khuếch đại được phát hiện càng sớm và giá trị C T càng thấp. Do vậy, C T được sử dụng làm công cụ để tính toán lượng DNA ban đầu trong mỗi phản ứng. Chu kỳ ngưỡng này cần được thiết lập phía trên đường tín hiệu nền và nằm trong pha tăng trưởng hàm mũ, tại nơi mà đồ thị khuếch đại giống nhau nhất. Thông thường, với hệ máy của công ty Bio-Rad, giá trị chu kỳ ngưỡng do máy tự động thiết lập, đều này giúp ta tránh những sai sót chủ quan có thể xảy ra khi ta tự thiết lập chu kỳ. Tuy nhiên, máy vẫn cho phép ta có thể thiết lập chu kỳ ngưỡng trong những trường hợp đặc biệt [42]. Tính toán hàm lƣợng GMO Kết quả của phản ứng Real-time PCR là giá trị ΔRn, biểu thị sự khác biệt giữa giá trị Rn + (tín hiệu huỳnh quang của tất cả các mẫu) và Rn - (tín hiệu nền của phản ứng - tín hiệu huỳnh quang ban đầu hay tín hiệu của đối chứng âm). 32 Hàm lượng GMO của một mẫu có thể được tính bằng phương pháp dựng đường chuẩn dựa trên các nồng độ khác nhau của DNA - Đường thứ nhất dùng để định lượng gen đối chiếu - Đường thứ hai dùng định lượng trình tự mục tiêu của GMO Ở mỗi mẫu thí nghiệm, hàm lượng gen đối chiếu và gen mục tiêu được xác định bằng cách nội suy trên đường cong chuẩn. Từ đó, tỷ lệ hiện diện của GMO (phần trăm) sẽ được tính bằng thương số của lượng gen GMO trên lượng gen đối chiếu. Tuy nhiên, một điều cần chú ý là giá trị mẫu thí nghiệm cần phải nằm trong giá trị cao nhất và thấp nhất của cả hai đường cong chuẩn. Các giá trị nằm ngoài có thể là kết quả định lượng sai [42]. Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lƣợng cây trồng biến đổi gen [9][44] Dựa vào cấu trúc cơ bản của các gen chuyển vào thực vật, người ta chia thành các mức độ chuyên biệt để phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen như sau: - Phương pháp đại trà (Screening): Phương pháp này phát hiện các đoạn trình tự promoter hoặc terminator đặc biệt chỉ có ở cây đã được chuyển gen. Hai đối tượng chính của phương pháp này là promoter CAMV 35S và terminator nos do chúng hiện diện trong phần lớn cây trồng biến đổi gen trên thế giới.Tuy nhiên, khuyết điểm của chúng là các promoter va terminator mà ta phát hiện và định lượng có thể bắt nguồn từ virus hay vi khuẩn hiện diện trong các loại ngũ cốc tự nhiên hay tại khu vực trồng trọt. Vì vậy, chúng có thể gây ra hiện tượng dương tính sai khi phát hiện và định lượng chúng. Mặc khác, một khuyết điểm nữa là phương pháp này chỉ có thể định lượng tổng thành phần chuyển gen trong một mẫu thực phẩm hỗn hợp mà không thể chỉ ra chính xác thành phần nguyên liệu nào đã được biến đổi gen. - Phương pháp chuyên biệt gen (gene specific): đối tượng của phương pháp này là đoạn trình tự nằm trong gen mục tiêu, đó là gen chuyển nạp vào thực vật. điều này có nghĩa là, khi phát hiện được đoạn gen này thì chắc chắn đó là cây chuyển gen, ví dụ như khuếch đại một đoạn gen Cry IA(b). Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này là nó chỉ cho phép xác định một 33 nhóm sản phẩm biến đổi gen mà không cho phép ta xác định chính xác đó là sản phẩm nào. Một ví dụ là: Nếu ta phát hiện có trình tự gen Cry IA (b) trong mẫu hỗn hợp bắp và đậu nành đã chuyển gen Bt thì ta cũng không thể xác định chính xác thành phần nào đã được chuyển gen và tỷ lệ chuyển gen là bao nhiêu phần trăm. . - Phương pháp chuyên biệt xây dựng (construct specific): đối tượng củ phương pháp này là đoạn trình tự nằm giữa vùng promoter với vùng enhancer, vùng enhancer với vùng gen mục tiêu hay giữa vùng gen mục tiêu với vùng terminator. So với hai phương pháp trên, phương pháp này có thể cho ta biết chính xác hơn thành phần nào đã được chuyển gen do chúng có thể có sự kết hợp khác nhau giữa các trình tự nói trên. Tuy nhiên, trong tương lai, nếu một cấu trúc gen chuyển nạp (gồm: promoter, enhancer, gen và terminator) được sử dụng cho nhiều đối tượng khác nhau thì phương pháp này cũng không còn chính xác nữa. - Phương pháp chuyên biệt sự kiện chuyển gen (event specific). Đối tượng của phương pháp này là đoạn trình tự giữa vùng promoter và vúng gen thực vật hay giữa vùng terminator với vùng gen thực vật. Do đoạn trình tự này là độc nhất cho mỗi sự kiện chuyển gen, chúng không chỉ cho phép ta xác định chính xác thành phần nào đã được biến đổi gen trong mẫu hỗn hợp mà còn chính xác trong từng sự kiện chuyển gen khi một cấu trúc được chuyển nạp nhiều lần vào trong cùng một đối tượng. tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn trong giai đoạn phát triển và chưa được ứng dụng rộng rãi. Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp đại trà để định lượng promoter 35S trong mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Hạn chế của phương pháp này là tính chuyên biệt và chính xác không cao bằng 3 phương pháp còn lại. 34 Hình 2.19: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lƣợng GMO [44] Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lƣợng GMO dựa trên promoter 35S Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S - Trong nước: Vương Nguyễn Phương Lâm, 2003. Xây dựng phương pháp chuẩn đoán đậu nành chuyển gen và nghiên cứu hiện trạng các sản phẩm đậu nành chuyển gen nhập khẩu vào Việt Nam. Luận văn tốt nghiệp khoa Nông học, Trường ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Hồ Bích Liên, 2003. Xây dựng phương pháp chuẩn đoán bắp chuyển gen và nghiên cứu hiện trạng các sản phẩm bắp chuyển gen nhập khẩu vào Việt Nam. Luận văn tốt nghiệp khoa Nông học, Trường ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Trương Minh Mẫn, 2005. Bước đầu thiết lập quy trình phát hiện sản phẩm có nguồn gốc từ cây trồng biến đổi gen dựa vào promoter 35S và terminator nos. Luận văn tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh. Nguyễn Hồng Minh Ngọc, 2004. Hoàn thiện phương pháp chuẩn đoán nông sản chuyển gen dựa trên kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp khoa Nông học, Trường ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 35 - Ngoài nước: Brunnert Hans-Josef , Spener Friedrich and Börchers Torsten, 2001 . PCR- ELISA for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified Roundup Ready soybeans. Eur Food Res Technol (2001) 213:366–371. Fukuta Shiro, Mizukami Yuko , et al., 2004. Real-time loop-mediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms. Eur Food Res Technol (2004) 218:496–500. Định lƣợng GMO đựa trên promoter 35S M. Hardegger 7 P. Brodmann 7 A. Herrmann, 1999. Quantitative detection of the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative competitive PCR. Eur Food Res Technol (1999) 209 :83–87. [...]... 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNAQuy trình ly trích đề nghị Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Kiểm tra sự hiện diện của promoter 35S Phƣơng pháp 2: Phƣơng pháp 1: Real-Time PCR với thuốc nhuộm PCR truyền thống SYBR Green Phương pháp sàng lọc đề nghị Phƣơng pháp 1: Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO Thử nghiệm các phương pháp định lượng Phƣơng pháp 2: Định lượng bằng Real-Time. .. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 1 Nội dung nghiên cứu Trong phạm vi khóa luận này, các nội dung nghiên cứu của chúng tôi bao gồm các mục sau: - Xác định quy trình ly trích tốt nhất trong điều kiện thí nghiệm cho mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp - So sánh phương pháp sàng lọc sản phẩm biến đổi gen bằng Real-Time PCR với phương pháp PCR truyền thống - Xác định phương pháp định lượng bằng kĩ... Real-Time PCR Định lượng bằng Real-Time với thuốc nhuộm SYBR Green Phương pháp định lượng đề nghị PCR với mẫu dò Taqman Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng Các chỉ tiêu định lượng Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng khảo sát một số mẫu thị trƣờng Kết luận 4 Vật liệu thí nghiệm Vật liệu thí nghiệm trong khóa luận này được chọn như sau: - Đối chứng dương: bắp chuyển gen Bt 176 với hàm lượng. .. kĩ thuật Real-Time PCR với hóa chất là thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò Taqman - Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR - Định lượng promoter 35S trên một số sản phẩm bắp và thực phẩm có chứa bắp hiện diện trên thị trường Các vấn đề nghiên cứu này sẽ giúp chúng tôi xây dựng được một quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên trình tự promoter 35S và mở rộng sang các đối tượng... Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA Mục tiêu Thông qua việc so sánh các bước thực hiện, hóa chất sử dụng để xác định một quy trình ly trích DNA tốt nhất phục vụ cho các thí nghiệm sau Vật liệu Hạt bắp giống (B1) Phƣơng pháp thực hiện Dựa vào các tài liệu trong và ngoài nước chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình ly trích DNA như sau: - Qui trình 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp đơn giản... dương: bắp chuyển gen Bt 176 với hàm lượng thành phần chuyển gen là 1% cấp bởi GeneScan - Đối chứng âm: nước siêu sạch Các mẫu thí nghiệm được chọn lọc và mua ngẫu nhiên trên thị trường Tp Hồ Chí Minh và Đồng Nai: 37 38 Bảng 3. 1: Mẫu thí nghiệm Tên và đặc điểm của mẫu STT Kí hiệu 1 Bắp giống 1 B1 2 Bắp giống 2 B2 3 Bắp giống 3 B3 4 Bắp giống 4 B4 5 Bắp giống 5 B5 6 Bắp trái ăn tươi B6 7 Bột bắp nguyên... nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 3 Tiến trình thí nghiệm: Trong khóa luận này, các thí nghiệm được tiến hành theo tiến trình như sau:... pháp thực hiện Dựa vào các tài liệu trong và ngoài nước chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình ly trích DNA như sau: - Qui trình 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp đơn giản [36] - Qui trình 2: Tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB [38] 38 . nghiệm các phương pháp định lượng Kết luận Phương pháp định lượng đề nghị Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng Các chỉ tiêu định lượng Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp. Đồng Nai: Phƣơng pháp 1: Định lượng bằng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Kiểm tra sự hiện diện của promoter 35S Phƣơng pháp 2: Real-Time. các mục sau: - Xác định quy trình ly trích tốt nhất trong điều kiện thí nghiệm cho mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. - So sánh phương pháp sàng lọc sản phẩm biến đổi gen bằng Real-Time PCR