21 Bảng 2.6. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA. Thành phần Tên gọi Bản chất Tác dụng pH Ức chế hoạt động của những enzyme phân hủy (như enzyme DNase hoạt động ở pH=7). Tris-HCl Dung dịch đệm Duy trì pH phù hợp. EDTA ethylenediamine -tetraacetate Ức chế những enzyme phân hủy DNA. sodium acetat. Muối -Kết hợp với ethanol 100% kết tủa và rửa sạch DNA. -Bảo vệ DNA. CTAB hexadecyltrime- thylammonium- bromide. Chất tẩy cation. -Hòa tan màng tế bào. -Biến tính protein. -Thành lập phức hợp với những protein, polysaccha- ride. CIA chloroform- isoamylalcohol. Chiết xuất protein và những polycaccharide. isopropanol Kết tủa DNA. ß-mercaptoetha- nol Tác nhân phá hủy màng nhân và kháng lại sự oxi hóa. -Ức chế quá trình oxi hóa. -Phá vỡ màng nhân. -Bảo vệ DNA khỏi những quinone, disulfite, peroxi- dase, polyphenoloxydase. ethanol 100% -Kết tủa DNA. -Rửa sạch DNA. Có thể gây hại cho DNA do vậy phải kết hợp với muối. ethanol 70% Rửa sạch DNA. Không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp. 22  Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.  Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose. 2.2.6.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.  Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6]. 2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD  Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao [1] [6]. 2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:  Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…  Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6]. 23  Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995) [1] [6]. 2.2.7. Kỹ thuật AFLP 2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt giới hạn từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu. Những đoạn DNA được nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao [1] [6] [17] [18]. Nguyên lý kỹ thuật AFLP được trình bày trong hình 2.2. Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 24 2.2.7.2. Các bƣớc của kỹ thuật AFLP [17] Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản:  Bước 1: Tách chiết DNA. Tương tự như ở kỹ thuật RAPD, tuy nhiên chất lượng DNA sử dụng cho kỹ thuật AFLP phải tốt hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.  Bước 2: Cắt giới hạn và gắn adapter Bước này gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn bằng 2 enzyme cắt. Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ xung với những đoạn DNA vừa được cắt. Mục đích để tạo ra những khuôn DNA có trình tự 2 đầu đã biết, để trong 2 phản ứng PCR sau này người ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn. Để không cho các đoạn DNA vừa được cắt ra không bắt cặp lại với nhau, giai đoạn cắt và gắn adapter được thực hiện đồng thời và được coi như một bước.  Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification) Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3 ’ . Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 1 nucleotide (thường là C). Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thường là A). Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc). Với việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn có gắn với adapter. 25 Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.  Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification) Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3 ’ . Mục đích chính của bước này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã được cắt giới hạn và gắn adapter đã được nhân bản ở bước 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ xung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả. Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ xung với trình tự của adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide. Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ xung với trình tự của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản phẩm khi điện di). Bảng 2.7. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc lớn. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc nhỏ. EcoRІ-ACT FAM EcoRІ -ACA FAM EcoRІ -AAC NED EcoRІ -ACC NED EcoRІ -AGC NED EcoRІ -AAG JOE EcoRІ -AGG JOE EcoRІ -ACG JOE EcoRІ-TG FAM EcoRІ-TC FAM EcoRІ-AC FAM EcoRІ-TT NED EcoRІ-AT NED EcoRІ-TA JOE EcoRІ-AG JOE EcoRІ-AA JOE 26 Bảng 2.8. Những primer MseI nhân bản chọn lọc. Những primer MseІ nhân bản chọn lọc MseІ-CAA MseІ-CAC MseІ-CAG MseІ-CAT MseІ-CTA MseІ-CTC MseІ-CTG MseІ-CTT  Bước 5: Điện di và phân tích kết quả Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide. Nguyên lý hoạt động của máy giải trình tự: Khi sử dụng máy giải trình tự để điện di, các sản phẩm của phản ứng nhân bản chọn lọc sẽ được hút qua những ống mao quản có đường kính rất nhỏ, bên trong có polymer. Trong phản ứng nhân bản chọn lọc, các primer EcoRI có gắn chất phát huỳnh quang trước đó, vì vậy khi các sản phẩm nhân bản chọn lọc đi qua một camera laser, chúng sẽ phát màu, khi đó một đầu dò cực nhạy sẽ thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra này và truyền tín hiệu về máy tính sử lý. Độ dài của các đoạn được nhân bản chọn lọc sẽ được tính toán dựa vào vị trí tương đối của chúng với những band chuẩn có kích thước đã biết. Kết quả điện di trên máy giải trình tự cho độ chính xác rất cao, có thể phân biệt các band chỉ chênh lệch nhau đến vài nucleotide [17]. 27 2.2.7.3. Những ƣu điểm của kỹ thuật AFLP  Kỹ thuật AFLP phù hợp cho tất cả các đối tượng nghiên cứu là thực vật, động vật và vi sinh vật mà không cần biết trước trình tự bộ gene.  Không giống như kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn và nhân bản một cách ngẫu nhiên, cho kết quả có độ tin cậy không cao, kỹ thuật AFLP sử dụng 2 primer dài, cho kết quả đáng tin cậy và ổn định (kết quả giống nhau khi được lập lại nhiều lần) do điều kiện thực hiện 2 phản ứng PCR nghiêm ngặt.  Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene có độ phân tách các band cao giúp phát hiện hầu hết những đoạn được nhân bản chọn lọc có độ dài gần bằng nhau mà khi điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide khó phát hiện được.  Khả năng xuất hiện đa hình lớn, nhận diện được chỉ thị trội với độ tin cậy cao. Đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao.  Sử dụng một lượng ít DNA so với RFLP [17]. 2.2.7.4. Những hạn chế của kỹ thuật AFLP  AFLP là kỹ thuật mới nên chưa được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu. Chi phí tiến hành cao và thiết bị phức tạp nên chưa thể thay thế hoàn toàn các kỹ thuật khác, đặc biệt là với các đối tượng nghiên cứu hoàn toàn mới.  Thao tác thực hiện khó, cần có đội ngũ chuyên viên được đào tạo lành nghề. 2.2.7.5. Ứng dụng của kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP được sử dụng cho những công việc:  Đánh giá đa dạng di truyền.  Nhận diện chỉ thị phân tử.  Xây dựng bản đồ gene. 28 2.2.8. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể như những ưu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể được so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí như bảng 2.9. Bảng 2.9. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử. Các yếu tố chính AFLP RAPD SSR RFLP Allozyme Số lượng thông tin Khả năng đáng tin cậy Độ phân giải Cách tiến hành Thời gian tiến hành Cao Cao Cao Vừa phải Ngắn Cao Biến đổi Vừa phải Dễ Ngắn Cao Cao Cao Khó (*) Dài (*) Thấp Cao Cao Khó Dài Thấp Cao Vừa phải Dễ Ngắn (*): Khi chưa phát hiện được trình tự primer. Nếu đã có trình tự primer thì thời gian tiến hành ngắn và cách thức tiến hành dễ (Theo Hillis và ctv, Karp và Edwards, 1998) [17] 2.2.9. Kỹ thuật PCR Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA khuôn thành hàng triệu bản giống hệt nhau và giống hệt chuỗi DNA khuôn qua vài chục chu kỳ nhiệt độ luân chuyển liên tục, sử dụng các primer bắt cặp bổ sung với chuỗi DNA khuôn, enzyme polymerase gắn các dNTPs vào với nhau theo một trình tự bổ xung với trình tự của chuỗi DNA khuôn, bắt đầu từ đầu 3 ’ của các primer [1] [5] [6] [8] [10] [11] [12] [14]. 2.2.9.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR Được miêu tả qua 3 giai đoạn: 29  Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92 o C – 96 o C) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó.  Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thường được tiến hành ở nhiệt độ 50 o C – 56 o C.  Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3 ’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thường được tiến hành ở 70 o C – 72 o C. Phản ứng PCR được tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTPs, enzyme polymerase, các primer, MgCl 2 , dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ. Nguyên lý kỹ thuật PCR được trình bày trong hình 2.3 và hình 2.4. 30 Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR 2.2.9.2. Quy trình chuẩn của phản ứng PCR Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất:  Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR: Nồng độ enzyme: thường sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme. Các dNTPs: Hàm lượng các dNTPs trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTPs (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương đương nhau. Hàm lượng MgCl 2 : Nồng độ tối ưu của MgCl 2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg + có thể ảnh hưởng đến: - Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn. Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài . kết hợp kỹ thuật RFLP và RAPD l p bản đồ gene tms – 1 của dòng l a TGMS (5460S) (Wang và ctv, 199 5) [1] [6]. 2.2.7. Kỹ thuật AFLP 2.2.7.1. Nguyên l kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP (Amplified. chính xác.  Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose. 2.2.6.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành. AFLP 24 2.2.7.2. Các bƣớc của kỹ thuật AFLP [17] Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản:  Bước 1: Tách chiết DNA. Tương tự như ở kỹ thuật RAPD, tuy nhiên chất l ợng DNA sử dụng cho kỹ