31 - Quá trình bắt cặp của primer: MgCl 2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA template. - Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác. - Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thường hàm lượng ion Mg + cần thiết từ 0,5 – 2.5 mM.  Chu trình nhiệt: Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94 o C trong 5 phút để hầu như tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau. Nhiệt độ biến tính: 94 o C – 96 o C trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trước tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo. Nhiệt độ bắt cặp: 55 o C (50 o C – 56 o C) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp). Nhiệt độ nối dài: 72 o C trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài. Ba bước này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ. Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72 o C trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ được bảo quản ở 4 o C hay –20 o C. 2.2.9.3. Tối ƣu hoá phản ứng PCR Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trưng riêng. Các biện pháp tối ưu đó liên quan đến những vấn đề: 32  Trình tự của primer: Theo nguyên tắc, primer càng dài sự bắt cặp càng chuyên biệt và ngược lại. Mục đích của việc thiết kế primer là có được sự cân bằng giữa sự chuyên tính (bắt cặp hoàn toàn bổ xung giữa những nucleotide của primer với những nucleotide của DNA template) và hiệu quả của PCR (tạo ra càng nhiều sản phẩm gần với lý thuyết tính toán càng tốt). Trình tự của primer xác định kích thước, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).  Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2 o C, trong đó: Tm = 2 o C x (A+T) + 4 o C x (G+C) (Suggs và ctv, 1981) Với A, T, G, C là số lượng các nucleotide tương ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ước lượng.  Nồng độ MgCl 2 : ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng, người ta thường thay đổi nồng độ của MgCl 2 trước tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.  Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thường khoảng 200 μM.  Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).  Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thường là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA.  Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa.  Tỉ lệ primer/DNA template: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện do lượng DNA template thấp và lượng primer quá cao. Ngược lại sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản. 33 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Nguyên liệu Thực hiện các thí nghiệm trên 80 mẫu lá điều thu thập tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Cách thức chọn mẫu, lấy mẫu và bảo quản mẫu xem phần 3.2.1. 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:  Giai đoạn 1: Thực hiện việc thu thập mẫu lá cây điều trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Giai đoạn thu thập mẫu được thực hiện từ 20/02/2005 – 11/03/2005.  Giai đoạn 2: Thực hiện tách chiết DNA, kỹ thuật RAPD và kỹ thuật AFLP tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật và Vi Sinh Vật, Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh, Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Giai đoạn thực hiện trong phòng thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. 3.1.2. Hóa chất cần thiết 3.1.2.1. Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều  Dung dịch chloroform – isoamyl alcohol (CIA) có tỉ lệ chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1.  RNase (10 mg/ml) – enzyme phân huỷ RNA.  Dung dịch isopropanol lạnh.  Sodiumacetate 3 M.  Ethanol 96 % và ethanol 70 %.  Agarose. 34  TAE (Tris – Acetate – EDTA).  Dịch tách chiết EB (Extraction buffer), pha 100 ml (bảng 3.1). Bảng 3.1. Thành phần và cách pha EB. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 100 ml) CTAB (hexade- cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M Mercaptroethanol NaCl 5 M Tris – HCl 0,5 M Nước 2 g. 4 ml. 1 ml. 28 ml. 20 ml. Thêm cho đến 100 ml.  Dung dịch TE 1 X (Tris – HCl và ethylendiamine tetra acetate), cách pha (bảng 3.2). Bảng 3.2. Thành phần và cách pha TE 1 X. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 250 ml) Tris – HCl 1 M EDTA 0,5 M 1 ml. 0,2 ml  Loading dye.  Ethidiumbromide.  Nước cất siêu sạch khử ion. 35 3.1.2.2. Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD  Bộ Taq polymerase (Biorad) và Taq polymerase (ABgene) gồm: Taq polymerase, MgCl 2 và Taq buffer.  dNTPs.  Primer 1, primer 2, primer 9 và primer 11 (IDT, Mỹ).  Agarose (Pháp).  Loading dye 6 X  Ladder 100 basepairs (Invitrogene).  Ethidiumbromide.  Nước cất siêu sạch khử ion, chiếu tia UV. 3.1.2.3. Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP (Applied Biosystem)  2 enzyme cắt: EcoRI và MseI.  Dung dịch đệm 5 X (50 mM Tris – HCl pH 7,0; 50 mM MgAc; 250 mM KAc).  2 adapter: EcoRI adapter và MseI adapter.  ATP 10 mM.  T4 DNA ligase.  Core mix Pre – selective amplification.  2 primer nhân bản tiền chọn lọc: EcoRI và MseI.  Core mix Selective amplification.  Primer EcoRI nhân bản chọn lọc.  Primer MseI nhân bản chọn lọc.  Nước cất siêu sạch, khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV.  Hidi.  Polyacrylamide. 36  Thang chuẩn Gene Scan. 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.1.3.1.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết và kiểm tra DNA  Chày cối nghiền mẫu (Đức).  Cân điện tử (Ohaus, Mỹ).  Ống eppendorf 1,5 ml (Pháp).  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Nichiryo, Nhật).  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Đức).  Bao tay (Malaysia).  Máy vi ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức).  Tủ sấy (Anh).  Tủ ủ mẫu (Anh).  Tủ – 20 o C (Sanyo, Nhật).  Nồi hấp autoclave (Nhật).  Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật).  Máy vortex (Đức).  Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh).  Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad, Thụy Điển).  Giếng đổ gel. 3.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Bao tay.  Tủ hút (Việt Nam / Anh). 37  Tủ lạnh các loại (Nhật).  Ống eppendorf 200 μl.  Máy PCR PTC Thermocycle 100.  Giếng đổ gel.  Máy điện di (Biorad).  Máy chụp hình DNA Geldoc. 3.1.3.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Đá gel, bao tay.  Tủ hút.  Tủ lạnh các loại.  Ống eppendorf 200 μl.  Giếng đổ gel.  Máy điện di.  Máy chụp hình DNA Geldoc.  Máy PCR Biorad (Biorad, Thụy Điển).  Bộ máy sequencing AB 3100 (Applied Biosystems, Mỹ). 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Phần thu thập mẫu Thực hiện thu thập mẫu lá điều của những cây điều đặc biệt và điển hình. 3.2.1.1. Phƣơng pháp chọn mẫu Tiến hành thu thập mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình trong vườn của những nông hộ được khảo sát theo mẫu in sẵn (xem phụ lục). 38 Lựa chọn nông hộ để khảo sát một cách ngẫu nhiên. Những đặc điểm nổi bật được chọn chủ yếu gồm:  Năng suất: cao hay thấp.  Ra hoa: nhiều hay ít, sớm hay muộn, một đợt hay nhiều đợt, nở đồng loạt hay phân tán.  Chùm: nhiều hay ít, một chùm có nhiều hay ít hạt.  Hạt: to hay nhỏ, màu sắc hạt.  Thân và cành cây: sum suê hay thưa thớt.  Hiện tượng rụng trái non: nhiều hay ít.  Quả: to hay nhỏ, màu sắc, ngon hay dở.  Khả năng chống chịu sâu hại: cao hay thấp.  Khả năng chống chịu bệnh: cao hay thấp. 3.2.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu Sau khi chọn được cây điều có những đặc điểm nổi bật đáng quan tâm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá. Lấy khoảng 4 – 5 lá còn non hay lá đã trưởng thành, không lấy lá đã già, chọn những lá tốt, không bị rách hay bị sâu hại, lau sạch rồi cho vào bọc nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và được giữ mát trong thùng đá. Sau đó mẫu được giữ trong ngăn đá tủ lạnh và sau vài ngày chúng tôi đem mẫu giữ ở tủ –20 o C tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.2.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm Trong phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành những công việc:  Thực hiện tách chiết và kiểm tra DNA của các mẫu lá điều thu thập được.  Thực hiện kỹ thuật RAPD.  Thực hiện kỹ thuật AFLP. 39 3.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết và kiểm tra DNA lá điều  Phương pháp tách chiết: Tách chiết DNA dựa trên phương pháp của Doyle và Doyle (1988). Phương pháp này dựa vào tính chất của CTAB như đã trình bày. Quy trình tách chiết gồm 12 bước: Bước 1: Cân 0,2.g lá đã rửa sạch cho vào cối nghiền mẫu, cho vào 1,2.ml dịch trích EB để nghiền lá với dung dịch này. Vortex kỹ. Ủ ở 65 o C trong 45 phút. Bước 2: Thêm 500 μl chloroform:isoamylalcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10 o C. Bước 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2. Bước 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 μl RNase, ủ ở 37 o C trong 1 giờ. Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –20 0 C trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Bước 6: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10 o C. Đổ bỏ dịch trong. Bước 7: Cho vào 300 μl TE 1X, ủ 37 o C trong 1 giờ. Bước 8: Thêm 20 μl muối sodium acetate 3 M và 640 μl ethanol 96 % (hay 100 %), trộn đều và để –20 o C trong 30 phút. Bước 9: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 10 o C. Bước 10: Rửa cặn với 400 μl ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 10 o C. Đổ bỏ dịch trong. Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37 o C trong 30 phút. Bước 12: Bảo quản mẫu ở 4 o C.  Phương pháp kiểm tra DNA: Có 2 phương pháp kiểm tra DNA: Phương pháp đo mật độ quang phổ: Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết 40 quả thu được. Kết quả nếu giá trị tỉ số OD 260 nm /OD 280 nm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì mẫu DNA tương đối sạch, có thể sử dụng được cho phản ứng PCR. Định lượng DNA theo công thức: Lượng DNA (ng/μl) = ( 62,9 x OD 260 nm –36 x OD 280 nm ) x n với “n” là hệ số pha loãng. Phương pháp điện di: Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có bẩn không,…) tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác. Điện di bằng gel agarose 1,0 %. Kết quả được đọc trên máy UV. 3.2.2.2. Kỹ thuật RAPD Tiến hành kỹ thuật PCR – RAPD với các primer (bảng 3.3). Bảng 3.3. Các primer sử dụng cho kỹ thuật PCR – RAPD. Các primer sử dụng Đặc điểm Primer 1 5 ’ TGCCGAGCTTG 3 ’ ; Tm = 40,7 o C; MW = 3.044. Primer 2 5 ’ AGTCAGCCAC 3 ’ ; Tm = 34,3 o C; MW = 2.997. Primer 9 5 ’ GGTACTCCCC 3 ’ ; Tm = 33,9 o C; MW = 2.964. Primer 11 5 ’ GAGACGCACA 3 ’ ; Tm = 35,3 o C; MW = 3.046. Trong quá trình thực hiện chúng tôi bố trí một số thí nghiệm nhằm tìm ra quy trình thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD phù hợp cho cây đìều:  Thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình do Samal và ctv (2003) đưa ra, thành phần hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt độ của thí nghiệm 1 được trình bày trong bảng 3.4. Thực hiện với 4 primer: 1; 2; 9 và 11. . nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP  Các loại pipette 0,5 l – 10 l và 10 l – 100 l.  Các loại đầu tipe 0,5 l – 10 l và 10 l – 100 l.  Đá gel, bao tay.  Tủ hút.  Tủ l nh các loại.  Ống. Giếng đổ gel. 3.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD  Các loại pipette 0,5 l – 10 l và 10 l – 100 l.  Các loại đầu tipe 0,5 l – 10 l và 10 l – 100 l.  Bao. chiết và kiểm tra DNA l điều  Dung dịch chloroform – isoamyl alcohol (CIA) có tỉ l chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1.  RNase (10 mg/ml) – enzyme phân huỷ RNA.  Dung dịch isopropanol l nh.