61 những band đa hình này để biết chính xác độ dài và trình tự của chúng có thật sự bằng nhau hay không. Trong 8 band đa hình mà chúng tôi phát hiện được, các band 600 base pairs, 700 base pairs là 2 band rất đáng quan tâm, có thể giải trình tự và sử dụng như những chỉ thị phân tử để phân biệt những cây có những tính trạng đáng quan tâm (thống kê ở bảng 4.3). 4.2.2.6. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD khá ổn định, cho nhiều band, có độ phân giải và độ sáng khá tốt, song còn một số vấn đề:  Khả năng nhân bản qua phản ứng PCR cao, tuy nhiên khả năng làm phát sinh chỉ thị phân tử lại thấp, thể hiện ở mức độ giống nhau về số lượng và độ dài các band trong tổng số các mẫu thực hiện PCR – RAPD thành công. Như vậy, hiệu quả phát hiện chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD có hạn chế.  Một số mẫu không ra kết quả tốt: Chúng tôi nhận thấy một điều là những mẫu ra kết quả không tốt là những mẫu lá trưởng thành nhưng còn mềm, có nồng độ DNA ly trích được rất thấp (chỉ khoảng 20 – 30 ng/μl). Với những mẫu này có thể thực hiện lại và có thể cho nhiều hơn 1 μl DNA khuôn vào hỗn hợp phản ứng.  Một số band tách không rõ: Có thể trong quá trình điện di, các band có độ dài gần bằng nhau nên khó tách ra rõ ràng. Chúng tôi sử dụng nồng độ 2 % agarose và điện di ở 50 V trong 1 h cho độ phân tách cao hơn, đồng thời điện di trong bồn lớn hơn xong vẫn gặp một số khó khăn, điển hình là các band di chuyển không đều, có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến sự di chuyển của các DNA. Những mẫu này nên thực hiện lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. 4.2.2.7. Phân tích kết quả phản ứng PCR – RAPD bằng phần mềm NTSYS Kết quả phát hiện band được đem sử lý bằng phần mềm NTSYSpc2.1. Các band được mã hoá dạng nhị phân, theo nguyên tắc có band thì ghi 1 và không có band thì ghi 0 (phụ lục 5). Kết quả được hiển thị theo dạng số liệu và dạng cây di truyền. 62 4.2.2.8. Đánh giá đa dạng di truyền Đánh giá đa dạng di truyền thông qua cây di truyền dựa trên các yếu tố:  Hệ số tương đồng di truyền.  Mức độ phân nhánh của cây di truyền. Trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, các huyện Tân Thành, Xuyên Mộc và Châu Đức có diện tích trồng điều nhiều nhất, vì vậy chúng tôi chủ yếu thu thập mẫu ở những huyện này. Khi đánh giá đa dạng di truyền của cây điều của từng huyện chúng tôi có các kết quả sau: Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Châu Đức: Có 7 mẫu có kết quả PCR – RAPD, kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền (hình 4.11 và 4.12). Hình 4.11. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với các mẫu thu được tại huyện Châu Đức. Bảng số liệu hiển thị mức độ tương quan di truyền giữa các mẫu một cách chính xác và cụ thể, song không tiện để đánh giá tổng thể nhiều mẫu nên thường sử dụng dạng cây di truyền để phân tích. 63 Hình 4.12. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Châu Đức. Các mẫu cây điều thu được ở huyện Châu Đức chia làm 2 nhánh riêng biệt, có mức độ tương đồng về di truyền khoảng 52 %. Nổi bật là CD39 và CD44 giống nhau đến khoảng 91 %, trong khi CD39 cho năng suất không cao nhưng CD44 lại cho năng suất rất cao. Các mẫu có mức độ giống nhau từ 73 % - 91 %, chia ra làm 5 nhánh nhỏ (trung bình 1,4 mẫu/nhánh). Nhận xét chung là tính đa dạng di truyền ở mức trung bình khá. Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Xuyên Mộc (hình 4.13): Các mẫu cây điều thu được ở huyện Xuyên Mộc chia làm 2 nhánh khác biệt, có mức độ tương đồng di truyền khoảng 61 %. Điểm đặc biệt là các cây thu thập được mẫu của huyện Xuyên Mộc đều có tính chất chung là năng suất rất cao nhưng lại thuộc những nhánh khác biệt nhau, dù mức độ khác biệt không cao (từ 80 % – 90 %). Cây di truyền chia ra làm 6 nhánh, trung bình 1,3 mẫu/nhánh). Các cây điều ở huyện Xuyên Mộc có thể có mức độ đa dạng cao hơn huyện Châu Đức. 0,52 0,62 0,71 0,81 0,91 Coefficient CD39 CD44 CD40 CD43 CD45 CD41 CD53 64 Hình 4.13. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Xuyên Mộc. Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Tân Thành (hình 4.14). Hình 4.14. Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Tân Thành. 0,68 0,76 0,84 0,92 1,0 Coefficient TT1 TT29 TT31 TT4 TT7 TT10 TT11 TT12 TT22 TT21 TT6 TT8 TT33 TT9 TT14 TT5 TT13 TT15 TT19 TT17 TT27 TT36 0,61 0,71 0,81 0,90 1,0 Coefficient XM61 XM64 XM70 XM72 XM78 XM76 XM77 XM79 65 Các mẫu cây điều thu được ở huyện Tân Thành chia ra làm 2 nhánh tương đồng di truyền khoảng 68 %, tuy chia ra nhiều nhánh nhỏ (12 nhánh, trung bình 1,8 mẫu/nhánh) nhưng lại có mức độ tương đồng di truyền khá cao, do có nhiều mẫu hoàn toàn giống nhau về di truyền và một số mẫu có mức độ tương đồng di truyền khá cao (80 % - 90 %), vì vậy mức độ đa dạng di truyền chỉ ở mức trung bình. Đặc biệt có TT12 có tính trạng ra hoa nhiều nhưng trễ, rụng trái non nhiều lại hoàn toàn giống với TT4, TT7, TT10, TT22 ra hoa sớm và ít rụng trái non. Tương tự, TT13 cũng mang những tính trạng hoàn toàn khác biệt so với TT15 và TT19 nhưng 3 mẫu này lại hoàn toàn tương đồng nhau về di truyền. Các cây điều thu được ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu: Đây là 2 nơi chúng tôi thu thập được ít mẫu nhất do diện tích canh tác rất ít và phân tán, do vậy không phát hiện được những cá thể nổi trội (hình 4.15). Hình 4.15. Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu. Tóm lại, bước đầu chúng tôi nhận thấy quần thể điều tại các địa phương trong tỉnh chỉ ở mức trung bình. Để giải thích điều này có nhiều lý do, song chúng tôi nhận định một lý do chủ yếu là: Địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có điều kiện tự nhiên (đất đai và khí hậu) phù hợp cho việc canh tác cây điều với mục đích kinh tế là chính, vì vậy nông dân thường chọn mua cây giống có chất lượng tốt từ các công ty giống hay chọn những cây mẹ có chất lượng tốt nhất lấy hạt làm giống, vì vậy làm cho quần thể điều của tỉnh có mức độ tương đồng di truyền cao. 0,60 0,63 0,65 0,67 0,70 Coefficient VT38 BR46 BR49 BR50 66 Qua phỏng vấn nông hộ chúng tôi nhận thấy người nông dân thích chọn những cây điều có những đặc điểm: năng suất cao, ra hoa nhiều (tốt nhất là ra hoa nhiều và sớm để tránh bị ảnh hưởng của sương muối và thời tiết quá khô hạn) và hạt to. Chúng tôi thực hiện đánh giá mức độ đa dạng di truyền của những đặc điểm này và thu được kết quả: Với đặc điểm cho năng suất cao: Trong 41 mẫu thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 31 mẫu cho năng suất rất cao. Mức độ đa dạng di truyền được đánh giá thông qua cây di truyền (hình 4.16). Hình 4.16. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho năng suất cao. 0,57 0,68 0,79 0,89 1,00 Coefficient TT1 TT29 CD44 BR49 TT4 TT6 TT8 TT10 TT11 TT22 XM72 XM78 TT33 BR50 CD53 XM76 TT15 TT17 TT27 XM64 XM70 TT5 TT19 TT36 XM77 BR46 TT31 CD45 CD43 CD40 XM79 67 Với đặc điểm cho năng suất cao, các cây điều của tỉnh chia ra làm 2 nhánh lớn có mức độ tương đồng khoảng 57 %, trong đó các nhánh lại phân thành nhiều nhóm nhỏ khác. Mặc dù được phân thành nhiều nhóm nhỏ (21 nhóm, trung bình 1,5 mẫu/nhóm) nhưng các cá thể cùng nhóm lại có mức độ tương đồng khá cao (như CD40 và XM79 có mức độ tương đồng khoảng 90 %). Những cá thể điều cho năng suất cao ở huyện Tân Thành có mức độ tương đồng rất cao, có thể đến 100 % (theo hướng mũi tên trên hình 4.16). Vì vậy, nhận xét chung của chúng tôi là tính đa dạng của các cây điều cho năng suất cao tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình, có nghĩa là các cây điều cho năng suất cao ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có mức độ tương đồng về bản chất di truyền cao, điều này có thể giải thích dựa vào cách nông dân nhân giống điều và sử dụng cây giống của các công ty giống cây trồng. Điều này chứng tỏ nông dân trong tỉnh đã có ý thức khá tốt về việc canh tác cây điều, rất thuận lợi cho chiến lược phát triển cây điều cao sản của tỉnh. Với đặc điểm cho hạt to: Cây di truyền biểu hiện 15 mẫu của những cây cho hạt rất to (hình 4.17). Hình 4.17. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho hạt to. 0,59 0,69 0,80 0,90 1,0 Coefficient TT1 TT33 BR49 CD39 TT5 TT13 TT7 TT14 CD45 CD53 XM64 XM70 XM72 XM76 CD41 68 Đặc điểm cho hạt rất to chia ra làm 2 nhánh có mức tương đồng di truyền khoảng 59 %, trong đó các cá thể trong từng nhánh nhỏ có mức tương đồng khá cao (từ 65 % - 100%). Cây di truyền chia ra làm 14 nhánh, trung bình 1,1 mẫu/nhánh. Điều này nói lên tính đa dạng di truyền cao của các cá thể mang đặc điểm cho hạt to. Đặc điểm hạt to được người nông dân rất ưa chuộng, do bán được giá cao hơn so với hạt nhỏ, còn có thể cho năng suất cao hơn nếu như cây cho nhiều hoa và đậu nhiều quả. Đặc điểm ra hoa nhiều: Cây di truyền thể hiện 22 mẫu các cây ra hoa nhiều (hình 4.18). Hình 4.18. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm ra hoa nhiều. Cây di truyền phân thành 2 nhánh có mức độ tương đồng di truyền khoảng 66 %. Chúng tôi vẫn thấy các cây điều tại huyện Tân Thành có mức độ tương đồng rất cao (hướng mũi tên), TT12 cho hoa nhiều nhưng rất trễ nhưng lại hoàn toàn giống với TT4, TT7, TT22 cho hoa rất sớm. Cây di truyền chia ra làm 13 nhánh, trung bình 1,7 0,66 0,75 0,83 0,92 1,0 Coefficient TT4 TT7 TT10 TT11 TT12 TT22 XM72 XM78 BR50 XM76 TT27 XM64 XM70 XM79 TT13 TT15 TT17 BR46 XM77 TT29 TT31 CD41 69 mẫu/nhánh, các mẫu tương đồng nhau từ 73 % - 100 %. Đánh giá chung tính đa dạng di truyền của đặc điểm ra hoa nhiều chỉ ở mức trung bình. Như vậy, khi đánh giá tính đa dạng di truyền của các cây điều dựa trên những đặc điểm nổi bật chúng tôi thấy mức độ tương đồng về di truyền của các cá thể đối với từng đặc điểm nổi bật vẫn rất cao, đồng thời nhận thấy các cây điều của huyện Tân Thành có đặc điểm cho năng suất cao liên quan chặt chẽ với đặc điểm ra hoa nhiều. Cây điều của huyện Tân Thành có mức độ tương đồng di truyền rất cao, ở cả 3 đặc điểm: cho năng suất cao, hạt to và ra nhiều hoa. 4.2.2.9. Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Chúng tôi đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu trên cơ sở các mẫu đã thu thập (hình 4.19). Quần thể điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu về di truyền được chia ra làm 2 nhánh I và II có mức độ tương đồng di truyền khoảng 59 %. Trong đó:  Nhánh I chia ra làm 2 nhánh nhỏ hơn: I B chỉ có BR49 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 75 % với I A gồm 4 mẫu. Tại nhánh I A có CD39 có những đặc điểm khác biệt hoàn toàn so với CD44 nhưng 2 mẫu này lại giống nhau đến khoảng 92 %.  Tại nhánh II, chia ra làm 2 nhánh II A và II B . Nhánh II B chỉ có CD41 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 62 % với nhánh II A – nhánh có nhiều mẫu nhất. Nhánh II A chia thành 2 nhánh nhỏ hơn II A1 và II A2 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 72 %. Các mẫu có thể có những đặc điểm giống nhau (năng suất cao, hạt to, chống chịu sâu bệnh tốt,…) nhưng lại có bản chất di truyền giống nhau khoảng 75 % đến 100 % (TT5, TT17, TT36, XM77,…). Ngược lại, có những mẫu có một số tính trạng hoàn toàn trái ngược nhau nhưng lại hoàn toàn giống nhau về di truyền (TT12 ra hoa nhiều nhưng nở trễ, rụng nhiều trái non lại được xếp chung với TT10, TT11, TT22,…không mang đặc điểm giống TT12). 70 Hình 4.19. Cây di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Theo như cây di truyền, quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu được chia thành 26 nhánh, trung bình mỗi nhánh có 1,6 mẫu, có mức độ tương đồng di truyền từ 59 % đến 100 %. Theo đánh giá của chúng tôi thông qua kỹ thuật RAPD, quần thể 0,59 0,69 0,79 0,90 1,0 Coefficient I II II A II B II A2 II A1 II A1.1 II A1.2 I A I B . Rịa – Vũng Tàu Chúng tôi đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu trên cơ sở các mẫu đã thu thập (hình 4.1 9). Quần thể điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng. TT1 2). 70 Hình 4.19. Cây di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Theo như cây di truyền, quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng. thì ghi 1 và không có band thì ghi 0 (phụ l c 5). Kết quả được hiển thị theo dạng số liệu và dạng cây di truyền. 62 4.2.2.8. Đánh giá đa dạng di truyền Đánh giá đa dạng di truyền thông