21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005 3.1.2. Địa điểm Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu - Chế phẩm Biolactyl của Pháp - Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc - Đại mạch của trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH, máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nƣớc và bếp điện. - Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống nghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman. 3.2.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trƣờng MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36] - Môi trƣờng MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) - Môi trƣờng YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] - Môi trƣờng thử khả năng lên men đƣờng [11] - Môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng - Môi trƣờng thử khả năng phân giải gelatin - Môi trƣờng thạch bán lỏng di động - Môi trƣờng thử khả năng sinh indol Thành phần và tỉ lệ môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày ở mục 1 phần phụ lục. 22 3.2.5.Thuốc nhuộm và thuốc thử - Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] - Thuốc nhuộm Gram [11] - Thuốc thử uphenmen [11] - Thuốc thử DNS [10] - Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử đƣợc trình bày ở mục 2 phần phụ lục. 3.3. Phương pháp thí nghiệm 3.3.1. Phân lập và sơ chọn giống 3.3.1.1. Quan sát đại thể - Môi trƣờng MRS agar và YGC agar + Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc. Giống phân lập trên môi trƣờng YGC agar, CaCO 3 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh khuẩn lạc. + Thực hiện * Pha loãng mẫu trong nƣớc cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau. * Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trƣờng MRS agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 o C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ. * Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trƣờng YGC agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 o C. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. - Môi trƣờng MRS broth Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37 o C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trƣởng trong 24 giờ. 3.3.1.2. Quan sát vi thể Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ở mục 3.2 phần phụ lục). 3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31] - Thực hiện + Cấy vi khuẩn đã phân lập đƣợc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ. + Li tâm thu dịch trong. 23 + Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi màu. Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng: + Ống 1: 5 ml môi trƣờng MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. + Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. 3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11] - Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên men có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein. - Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục) 3.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 3.3.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng - Ảnh hƣởng pH Điều chỉnh pH môi trƣờng bằng CH 3 COOH và NaOH sao cho pH ban đầu là : 4, 5, 6, 7 (pH sau khi khử trùng ). Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % cao nấm men). Nuôi cấy ở 37 o C. Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng với các độ pH khác nhau. Chọn pH thích hợp cho sự tích lũy acid của các khuẩn lạc. - Ảnh hƣởng nhiệt độ Sau khi chọn đƣợc pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37 o C, 45 o C, 50 o C. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dich nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ mật rỉ Chọn đƣợc pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ nhƣ trên và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ giống Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ. Khảo sát tỉ lệ giống: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy tỉ lệ giống nhƣ trên cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng thời gian Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời 24 điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. 3.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa - Thử phản ứng catalase - Kiểm tra khả năng sinh indol - Xem khả năng di động - Khả năng khử nitrate - Khả năng phân giải gelatin - Khả năng đông vón sữa - Khả năng lên men nguồn carbohydrate Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục) 3.3.5. So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D - Môi trƣờng cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. - Môi trƣờng cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. - Môi trƣờng sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. 3.3.6. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 3.3.6.1. Định lượng đường khử [10] + Nguyên tắc: Có một vài tác nhân đƣợc sử dụng để định lƣợng đƣờng nhờ các đặc tính khử của đƣờng. 3,5 - dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino - 5 - nitrosalicylic có màu đỏ cam. + Thực hiện: (xem mục 3.3 phần phụ lục) 3.3.6.2. Định lượng vi sinh vật [16] - Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Cách tiến hành: (xem mục 3.4 phần phụ lục) - Thiết lập mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm của dịch huyền phù tế bào. 25 + Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Nhƣ vậy, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lƣợng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy. + Tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ đƣợc suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo ở bƣớc sóng 610 nm. + Thực hiện * Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu đƣợc dịch huyền phù có các giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. * Đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng ứng với 5 giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. * Dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x). 3.3.6.3. Qui trình sản xuất Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch H 2 SO 4 Vi khuẩn CaCO 3 H 2 SO 4 Dung dịch acid lactic Than hoạt tính 26 - Chuẩn bị môi trƣờng lên men Trƣớc tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H 2 SO 4 vào với tỉ lệ 3,5 ml H 2 SO 4 trong 1000 ml mật rỉ. Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu đƣợc phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5 % cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ƣu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic). - Giai đoạn lên men + Chuẩn bị giống để lên men * Giống cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. * Giống cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. * Giống sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. + Cho 10 % giống sản xuất vào môi trƣờng chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ƣu trong thời gian 7 ngày. - Giai đoạn tạo lactat canxi Trong thời gian lên men, lƣợng acid tạo ra liên tục nên ta phải trung hòa bằng CaCO 3 để cho pH ổn định cho khuẩn lạc đó. Sau khi kết thúc quá trình lên men, loại bỏ dịch trên, thu đƣợc phần lactat canxi. Đem trung hòa lƣợng lactat canxi bằng H 2 SO 4 , thu đƣợc phần dịch, đem lọc bằng than hoạt tính thu đƣợc dung dịch acid lactic. 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và sơ chọn giống 4.1.1. Quan sát đại thể 4.1.1.1. Môi trường MRS agar và YGC agar Từ các nguồn: Biolactyl, Antibio, Đại mạch, quá trình phân lập và làm thuần đƣợc 3 dạng khuẩn lạc sinh acid. Ký hiệu A, B, D. Khuẩn lạc A phân lập từ Antibio, khuẩn lạc B từ Biolactyl và khuẩn lạc D từ Đại mạch. Các khuẩn lạc trên đƣợc phân biệt dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích thƣớc của khuẩn lạc. - Trên môi trƣờng MRS agar + Khuẩn lạc A: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37 o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: màu trắng sữa, bóng ƣớt, bề mặt phẳng, hơi nhô lên, đƣờng kính khuẩn lạc 1,1 mm. Hình 4. 1: Hình dạng khuẩn lạc A + Khuẩn lạc B: Đƣợc ủ 48 giờ ở 50 o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, láng bóng, vun tròn và mép khuẩn lạc có bề phẳng và nhẵn bóng, đƣờng kính khuẩn lạc 1,4 mm. Hình 4. 2: Hình dạng khuẩn lạc B 28 + Khuẩn lạc D: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37 o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, màu trắng sữa, bóng ƣớt, đƣờng kính khuẩn lạc 0,5 mm. Hình 4. 3: Hình dạng khuẩn lạc D - Trên môi trƣờng YGC agar Khả năng tạo acid làm tan CaCO 3 của 3 khuẩn lạc nhƣ sau: Hình 4. 4: Khả năng làm tan CaCO 3 của khuẩn lạc A Hình 4. 5: Khả năng làm tan CaCO 3 của khuẩn lạc B Hình 4. 6: Khả năng làm tan CaCO 3 của khuẩn lạc D 29 Từ hình 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vòng trong suốt rộng nhất, kế đến khuẩn lạc D, cuối cùng khuẩn lạc B. Do khuẩn lạc A, B và D có khả năng chuyển hóa đƣờng thành acid nên phân giải CaCO 3 trong môi trƣờng tạo nên vòng trong suốt. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. 4.1.1.2. Môi trường MRS broth Sau khi nuôi vi khuẩn trên môi trƣờng MRS dịch thể chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 7: Khả năng phát triển trong môi trƣờng MRS dịch thể của các khuẩn lạc A, B và D. Từ hình 4.7 chúng tôi thấy: Khuẩn lạc A: Làm đục môi trƣờng, lắng nhiều sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc B: Làm đục môi trƣờng, lắng ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc D: Làm đục môi trƣờng, lắng rất ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Do khuẩn lạc A thích nghi nhanh trên môi trƣờng MRS, phát triển tốt cho nên tạo sinh khối nhiều hơn khuẩn lạc B và D. 4.1.2. Quan sát vi thể Sau khi tiến hành nhuộm Gram của các khuẩn lạc A, B và D chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 8: Nhuộm Gram của khuẩn lạc A, xem ở vật kính x 100 30 + Khuẩn lạc B: Tế bào hình que, tạo chuỗi dài, Gram dƣơng, không sinh bào tử Hình 4. 9: Nhuộm Gram của khuẩn lạc B, xem ở vật kính x 100 + Khuẩn lạc D: Tế bào hình cầu, đơn hoặc đôi, Gram dƣơng, không sinh bào tử. Hình 4. 10: Nhuộm Gram của khuẩn lạc D, xem ở vật kính x 100 4.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic Sau khi tiến hành định tính acid lactic bằng thuốc thử uphenmen chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Hình 4. 11: Khả năng sinh acid lactic, làm đổi màu thuốc thử uphenmen Từ hình 4.11 chúng tôi thấy màu của khuẩn lạc A, B và D giống với màu của acid lactic tinh khiết, khác với màu của môi trƣờng là do cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng tạo acid lactic, khi kết hợp với thuốc thử uphenmen thì chuyển từ màu xanh dƣơng đậm sang vàng. . ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. 3. 3.6. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 3. 3.6.1. Định lượng đường khử [10] + Nguyên tắc: Có. thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. + Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. 3. 3 .3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11] - Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên. Vi khuẩn CaCO 3 H 2 SO 4 Dung dịch acid lactic Than hoạt tính 26 - Chuẩn bị môi trƣờng lên men Trƣớc tiên phải xử lý mật r : Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H 2 SO 4