31 4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 4.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng Sau khi khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống, thời gian. Chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: 4.3.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự tạo acid tổng Bảng 4. 1: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 1,53 5 37 10 10 24 2,88 6 37 10 10 24 10,17 7 37 10 10 24 9,36 Qua bảng 4.1 chúng tôi thấy khuẩn lạc A tạo acid tổng nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn tối ƣu cho khuẩn lạc A. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 45 10 10 24 1,08 5 45 10 10 24 1,98 6 45 10 10 24 7,65 7 45 10 10 24 5,67 Qua bảng 4.2 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc B. Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 2,25 5 37 10 10 24 13,59 6 37 10 10 24 12,51 7 37 10 10 24 9,45 32 Từ bảng 4.3 chúng tôi thấy ở pH = 5 lƣợng acid tổng nhiều nhất nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc D pH = 5. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng Acid tổng (g/l) pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 Biểu đồ 4.1Ảnh hƣởng pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc: A, B và D 4.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Nhiệt độ ( o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o ) Phòng 6 10 10 24 7,29 37 6 10 10 24 14,04 45 6 10 10 24 9,36 50 6 10 10 24 1,37 Qua bảng 4.4 lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37 o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc A: 37 o C. Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Nhiệt độ ( o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o ) Phòng 6 10 10 24 2,07 37 6 10 10 24 4,59 45 6 10 10 24 7,83 50 6 10 10 24 6,3 33 Từ bảng 4.5 chúng tôi thấy ở nhiệt độ 45 o C thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc B: nhiệt độ 45 o C. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Nhiệt độ ( o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o ) Phòng 5 10 10 24 9,72 37 5 10 10 24 14,13 45 5 10 10 24 1,08 50 5 10 10 24 0,81 Từ bảng 4.6 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37 o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc D. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng Acid tổng (g/l) Độ phòng 37 độ C 45 độ C 50 độ C Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc A, B và D 4.3.1.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 %mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 7,11 10 %mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 16,65 15 %mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 14,22 20 %mât rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 11,16 34 Qua bảng 4.7 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ mật rỉ 10 % nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc A. Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 4,23 10 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 6,84 15 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 3,15 20 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 2,52 Qua bảng 4.8 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ mật rỉ 10 % nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc B. Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 7,47 10 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 12,6 15 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 9,72 20 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 8,64 Qua bảng 4.9 chúng tôi thấy ở tỉ lệ mật rỉ 10 % thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men cho khuẩn lạc D. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng Acid tổng (g/l) Mật rỉ 5 % Mật rỉ 10 % Mật rỉ 15 % Mật rỉ 20 % Biểu đồ 4.3 Ảnh hƣởng mật rỉ lên sự tạo acid tổng từ các khuẩn lạc A, B và D 35 4.3.1.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng Bảng 4.10: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 6 37 10 24 9,45 10 6 37 10 24 13,23 15 6 37 10 24 14,76 20 6 37 10 24 14,94 Qua bảng 4.10 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ giống 20 %. Tuy nhiên, với lƣợng giống nhiều sẽ tốn kém cho nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc A Bảng 4.11: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 6 45 10 24 3,69 10 6 45 10 24 6,57 15 6 45 10 24 7,38 20 6 45 10 24 7,47 Qua bảng 4.11 chúng tôi thấy ở tỉ lệ giống 20 % lƣợng acid tổng nhiều nhất. Tuy nhiên, về kinh tế chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men. Bảng 4.12: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 5 37 10 24 8,01 10 5 37 10 24 14,13 15 5 37 10 24 16,02 20 5 37 10 24 16,29 36 Qua bảng 4.12 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ giống 20 %. Tuy nhiên, về kinh tế thì tốn kém nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng Acid tổng (g/l) Giống 5 % Giống 10 % Giống 15 % Giống 20 % Biểu đồ 4.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc A, B và D 4.3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian lên sự tạo acid tổng Bảng 4.13: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 6 37 10 10 1,62 24 6 37 10 10 13,14 36 6 37 10 10 14,58 48 6 37 10 10 14,85 Qua bảng 4.13 chúng tôi thấy khuẩn lạc A ở 12 giờ acid tổng tạo thành ít, tạo acid tổng mạnh ở thời gian 24 giờ. Ở thời gian 36 giờ và 48 giờ lƣợng acid tổng tạo thành không tăng nhiều, có thể ở thời điểm này bắt đầu ở tỉ lệ cân bằng (pha ổn định), không có sự gia tăng mật độ của tế bào do tốc độ tăng trƣởng bằng tốc độ tế bào chết đi. Ở pha này, các chất dinh dƣỡng bị cạn kiệt trong khi các sản phẩm biến dƣỡng ức chế tăng trƣởng lại đƣợc tích lũy, nên acid tổng tạo thành yếu dần. 37 Bảng 4.14: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 6 45 10 10 1,35 24 6 45 10 10 7,47 36 6 45 10 10 8,64 48 6 45 10 10 8,73 Qua bảng 4.14 chúng tôi thấy khuẩn lạc B ở 12 giờ lƣợng acid tổng tạo ra rất thấp. Chỉ tạo nhiều ở 24 giờ . Ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ acid tổng tạo thành tăng không nhiều. Chứng tỏ ở các thời điểm này bắt đầu đạt trạng thái cân bằng. Bảng 4.15: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 5 37 10 10 3,78 24 5 37 10 10 14,04 36 5 37 10 10 16,2 48 5 37 10 10 16,83 Qua bảng 4.15 chúng tôi thấy khuẩn lạc D ở 12 giờ lƣợng acid tổng tạo ra thấp, tạo nhiều ở 24 giờ, còn 36 giờ và 48 giờ lƣợng acid tổng tạo thành không tăng nhiều. Chứng tỏ ở thời điểm này bắt đầu vào pha cân bằng. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng Acid tổng (g/l) 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ Biểu đồ 4.5 Ảnh hƣởng thời gian lên sự tạo acid tổng bởi các khuẩn lạc A, B và D 38 4.3.2. Đặc điểm sinh hóa Qua quá trình thử nghiệm các phản ứng sinh hóa chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: - Khả năng đông vón sữa: Bảng 4.16: Khả năng tạo acid tổng từ sữa của các khuẩn lạc: A, B, D Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ ( o C) Môi trƣờng sữa : ml Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) A 6 37 10 10 24 23,04 B 6 45 10 10 24 25,65 D 5 37 10 10 24 15,39 0 5 10 15 20 25 30 A B D Chủng Acid tổng (g/l) Biểu đồ 4.6. So sánh khả năng tạo acid tổng trên môi trƣờng sữa bởi các khuẩn lạc A, B và D Qua biểu đồ 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc B lên men sữa tạo acid tổng nhiều nhất, kế đến khuẩn lạc A và cuối cùng khuẩn lạc D. Chứng tỏ khuẩn lạc B phù hợp với môi trƣờng sữa nhất, kế đến khuẩn lạc A và cuối cùng khuẩn lạc D. Chúng tôi thấy cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng đông vón sữa. Khả năng đông vón: do các khuẩn lạc A, B và D đều có khả năng lên men đƣờng tạo thành các loại acid hữu cơ (trong đó lƣợng acid lactic nhiều nhất). Chính các acid hữu cơ này càng đƣợc tích lũy càng làm tăng nhanh quá trình tách canxi ra khỏi casein, khi lƣợng acid hữu cơ đủ nhiều, tạo pH đến điểm đẳng điện của casein thì sữa bị vón cục trở lại. 39 - Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau Sau khi tiến hành thử phản ứng lên men đƣờng chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: Hình 4. 12: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau của khuẩn lạc A Qua hình 4.12 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vật liệu di truyền tổng hợp nên các enzyme đồng hóa các loại đƣờng glucose, fructose, lactose, saccharose và maltose tạo acid nên làm môi trƣờng có chất chỉ thị phenol red từ màu đỏ chuyển sang vàng. Đối với các ống nghiệm chứa các loại đƣờng còn lại môi trƣờng vẫn còn màu của chất chỉ thị phenol red, do nó không có vật liệu di truyền tổng hợp các enzyme phân giải các loại đƣờng này. Kết quả trên phù hợp với Kulp và Rettger (trích dẫn bởi B. S. Robert, 1948). Hình 4. 13: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau của khuẩn lạc B Qua hình 4.13 chúng tôi thấy các ống nghiệm có chứa đƣờng glucose, fructose, lactose và saccharose chuyển thành màu vàng. Chứng tỏ khuẩn lạc B có vật liệu di truyền tổng hợp nên các enzyme biến đổi các loại đƣờng này tạo thành acid nên từ môi trƣờng chứa chất chỉ thị phenol red màu đỏ chuyển vàng. Đối với các loại đƣờng còn lại nó không có khả năng đồng hóa nên có màu đỏ. Kết quả trên phù hợp với Gigoroff và Cohendy (trích dẫn bởi B. S. Robert, 1948). 40 Hình 4. 14: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau của khuẩn lạc D Qua hình 4.14 chúng tôi thấy khuẩn lạc D có vật liệu di truyền tổng hợp các enzyme có khả năng chuyển hóa các loại đƣờng glucose, fructose, lactose và maltose thành acid, nên từ môi trƣờng có chất chỉ thị phenol red (màu đỏ) chuyển sang vàng. Đối với các ống nghiệm có chứa các loại đƣờng còn lại vẫn không thay đổi màu, do không có enzyme đồng hóa các loại đƣờng này. Kết quả trên phù hợp với (B. S. Robert, 1948). Bảng 4.17: Bảng tóm tắt các đặc tính của các khuẩn lạc A, B, D Khuẩn lạc Đặc điểm A B D Gram + + + Khả năng sinh bào tử - - - Khả năng sinh hơi - - - Khả năng di động - - - Khả năng khử nitrate - - - Khả năng phân giải gelatin - - + Phản ứng indole - - - Khả năng đông vón sữa + + + Khả năng phân giải carbohydrate Glucose + + + Fructose + + + Maltose + - + Lactose + + + Saccharose + + - Mannitol - - - Sorbitol - - - Dextrin - - - Glycerol - - - . 10 24 4, 23 10 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 6, 84 15 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 3,15 20 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 2,52 Qua bảng 4. 8 chúng. 5 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 7 ,47 10 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 12,6 15 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 9,72 20 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men. (g/l) Mật rỉ 5 % Mật rỉ 10 % Mật rỉ 15 % Mật rỉ 20 % Biểu đồ 4. 3 Ảnh hƣởng mật rỉ lên sự tạo acid tổng từ các khuẩn lạc A, B và D 35 4. 3.1 .4. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống lên sự