31 Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR Có 3 loại primer chính thường dùng trong giai đoạn tổng hợp cDNA * Primer là các oligo T Tất cả các loại mRNA đều có đuôi poly A ở đầu 3' nên với primer là một đoạn oligo T (ví dụ: TTTTTT) thì nó sẽ bắt cặp với sợi mRNA ở đoạn poly A và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài ứng với toàn bộ sợi mRNA khuôn. Phương pháp này rất thuận lợi cho những nghiên cứu tổng quát về mRNA. * Primer random hexamer Là những đoạn oligo nucleotide gồm 6 nucleotide với trình tự ngẫu nhiên. Chúng bám lên nhiều điểm khác nhau dọc theo suốt sợi mRNA và tổng hợp nên những đoạn cDNA ngắn phủ khắp sợi mRNA khuôn mẫu. Random hexamer thích hợp cho những sợi mRNA đích quá dài hoặc có nhiều cấu trúc thứ cấp gây cản trở cho oligo T hoạt động hiệu quả. 32 * Primer chuyên biệt Primer được thiết kế với một trình tự chuyên biệt cho một đoạn trình tự nhất định trên sợi mRNA. Primer sẽ bắt cặp ở trước đầu 3' của đoạn gene mong muốn và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài từ điểm bắt cặp kéo dài đến hết sợi mRNA khuôn. Do primer chỉ bắt cặp tại một điểm chuyên biệt nên cDNA tạo ra sẽ chứa đoạn trình tự mong muốn với xác suất rất cao, vì vậy, loại primer này đặc biệt hữu hiệu trong việc khuếch đại các mRNA có số lượng bản sao thấp. (O'Connell J., 2002). Phản ứng RT-PCR có thể được thực hiện theo 2 bước (two steps) hay diễn ra liên tục (one step). * Phản ứng qua 2 bước Trước tiên, thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với mRNA khuôn, primer và enzyme reverse transcriptase trong khoảng 45 phút ở 42 - 45 o C (là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme reverse transcriptase). Sau đó, bổ sung primer cho PCR, Taq - polymerase để thực hiện tiếp phản ứng khuếch đại. Phương pháp này thường được sử dụng với các primer tổng hợp cDNA là oligo T hay hexamer, giúp người thực hiện có thể khống chế được từng qui trình. Tuy nhiên dễ xảy ra nhiễm các DNA lạ khi bổ sung hóa chất giữa 2 giai đoạn. * Phản ứng liên tục Cho tất cả các yếu tố cần thiết cho cả phản ứng tổng hợp cDNA và phản ứng khuếch đại vào một lần rồi thực hiện cả 2 qui trình liên tục. Phương pháp này thường được thực hiện với các primer được thiết kế chuyên biệt chung cho cả phản ứng tạo cDNA lẫn phản ứng khuếch đại và ít gây nhiễm DNA lạ trong quá trình thao tác. 33 2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA (Sequencing) Để xác định trình tự của một đoạn DNA mong muốn, phương pháp Sanger là phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: thực hiện sự tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi cần xác định trình tự (thực hiện phản ứng PCR), nhưng ngoài 4 loại dNTP thông thường còn bổ sung thêm các dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP). Các ddNTP này không có nhóm -OH ở đầu 3' nên khi chúng gia nhập vào chuỗi sẽ làm cho sự kéo dài chuỗi bị dừng lại (do không thể tạo được liên kết giữa nhóm -OH 3' của nucleotide trước với nhóm phosphate 5' của nucleotide sau). Sự gia nhập của các ddNTP vào chuỗi là hoàn toàn ngẫu nhiên nên phản ứng kéo dài sẽ ngừng lại ở một vị trí bất kỳ. Do đó, nếu cung cấp một lượng DNA mẫu đủ lớn thì các phản ứng tổng hợp sẽ cho hàng loạt các sản phẩm có độ dài tăng dần: 1, 2, 3, 4… nucleotide. Như vậy, chỉ cần biết được ở mỗi đoạn kết thúc bằng loại ddNTP nào thì sẽ có thể tìm ra được trình tự của đoạn DNA mong muốn. Để làm được điều đó, người ta thực hiện 4 phản ứng PCR cho mẫu DNA muốn giải trình tự cùng lúc, ở mỗi phản ứng chỉ cho thêm một loại ddNTP (A, T, G hoặc C). Sau phản ứng, kết quả điện di sản phẩm của cả 4 trên cùng một gel acrylamide sẽ giúp xác định được trình tự của đoạn DNA (Bùi Trang Việt, 2002). Hiện nay, với các thế hệ máy đọc trình tự mới, các ddNTP được gắn thêm các chất phát màu huỳnh quang, mỗi loại ddNTP gắn với 1 màu khác nhau thay vì gắn với đồng vị phóng xạ như phương pháp kinh điển. Kết thúc phản ứng, các đoạn DNA sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản (capillary electrophoresis). Cuối cùng, từ kết quả điện di, máy sẽ đọc các màu huỳnh quang phát ra trên capillary và phân tích với các phần mềm chuyên dụng để cho ra trình tự các nucleotide của đoạn DNA quan tâm. 34 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Mẫu Mẫu nghiên cứu gồm chồi giống thương phẩm và các mẫu lá bệnh được lấy ngẫu nhiên từ 3 giống dứa Cayenne: - Giống Thái Lan và giống Lâm Đồng do nông trường Phạm Văn Hai cung cấp. - Giống Trung Quốc do nông trường Thọ Vực cung cấp. Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị - Máy ly tâm Mikro 22R - Máy vortex - Máy luân nhiệt iCycle (BioRad) - Bộ nguồn và bồn điện di (BioRad) - Bình đựng Nitơ lỏng - Pipetman, đầu tube và eppendorf các loại. 35 3.1.3 Hóa chất 3.1.3.1 Hóa chất dùng cho tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích Aurum TM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp: - Lysis solution. - Low stringency wash solution (X5). - High stringency wash solution. - DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trước khi sử dụng). - DNase dilution solution. - Elution solution. Ngoài ra, còn có các hóa chất khác cần cung cấp riêng: - β- mercaptoethanol, 14.2 M. - Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP), 2%. - Ethanol 100% và 70%. - Tris-base (pH 7.5, 10 mM). - Nitơ lỏng. - NaOH 0.1M. - EDTA 1mM. - DEPC (Diethyl pyrocarbonate). 3.1.3.2 Hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR - Primer cho phản ứng RT-PCR: Primer 225: 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' Primer 226: 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' (Theo thiết kế của Sether D.M và ctv, 2001) Cặp primer này sẽ khuếch đại từ vị trí nucleotide thứ 118 đến nucleotide 707 trên gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 cho ra sản phẩm có kích thước 589bp. 36 118 707 Đoạn khuếch đại 589bp Gene mã hóa HSP70 Primer 226 Primer 225 5’ 3’ Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226. Các hóa chất khác thuộc bộ kit Access RT-PCR System (Promega) gồm: - AMV / Tfl Buffer (5X) - dNTP (10mM) - MgSO 4 (25 mM) - Enzyme reverse transcriptase AMV (5 Unit/ µ l) - Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/ µ l) 3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA - Agarose (BioRad). - Ethidium bromide. - Loading dye 6X (Promega). - Nước cất 2 lần. - Dung dịch TAE 1X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8). - Thang DNA (100bp DNA ladder – Promega). 37 Hình 3.3: Thang DNA 3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA - MOPS buffer 5X (MOPS 10 mM, sodium acetat 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0). - Formaldehyde 37%. - Formamide. - Nước cất khử ion, khử RNase. - Dung dịch đặt mẫu biến tính (loading dye biến tính). 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tách chiết RNA Mẫu chồi dứa được lột hết các lá ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong cắt thành từng mảnh nhỏ (<5mm), nghiền thành bột mịn trong Nitơ lỏng rồi đem ly trích RNA với bộ kit Aurum Total RNA Mini Kit theo các bước: 1. Cho 60 mg mẫu vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy. Hòa tan mẫu bằngvới 700 µ l dung dịch ly giải (lysis solution). 2. Ly tâm dịch ly giải ở 14 000 vòng trong 3 phút, chuyển dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml mới. 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 38 3. Thêm 700 µ l ethanol 70% vào mỗi tube, hòa tan bằng pipet cho đến khi dung dịch không còn phân lớp. 4. Ủ ấm dịch hòa tan trong water bath 70 0 C (chuẩn bị cho bước 12). Đặt RNA binding column vào tube ly tâm 2 ml không nắp. 5. Cho 700 µ l dung dịch ở bước 3 vào RNA binding column, ly tâm 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho hết phần dịch còn lại. 6. Cho 700 µ l dịch rửa low stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. 7. Trộn 5 µ l DNase với 75 µ l dung dịch DNase delution (trong tube 1.5 ml), cho vào RNA binding column. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. 8. Cho 700 µ l dung dịch high stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc 9. Thực hiện tương tự bước 12 với dung dịch low stringency 10. Ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. 11. Chuyển RNA binding column vào tube 1.5 ml có nắp đậy, cho 80 µ l dịch hòa tan (elution solution) đã ủ ở 70 o C ở bước 5 vào, ủ 1 phút, ly tâm 2 phút để thu RNA tổng số. Dung dịch RNA được bảo quản ở 4 0 C. 3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA Nấu 16 ml gel 1,8%, chờ nguội đến khoảng 65 o C, cho thêm 4 ml MOPS 5X và 400 µl formaldehyde. Khi gel nguội, ngâm trong dung dịch MOPS 1X khoảng 30 phút trước khi điện di. Mẫu sản phẩm RNA trước khi điện di được làm biến tính ở 65 o C trong 30 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá khoảng 1 phút. Sau đó, trộn với dung dịch nạp mẫu biến tính rồi đem điện di ở 30V trong 150 phút. Sản phẩm điện di được quan sát dưới đèn cực tím. 39 3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR 3.2.3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của primer Trước khi được dùng làm mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1, cặp primer 225, 226 được kiểm tra các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT (http://www.scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/ ) và được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ). 3.2.3.2 Xác định chu trình nhiệt tối ưu Quy trình RT-PCR được thực hiện theo theo kiểu one step. Primer 226 sẽ thực hiện phản ứng reverse với tác động của enzyme reverse transcriptase, tổng hợp sợi cDNA từ RNA của PMWaV-1. Sau đó dưới tác động của Taq – polymerase, cả hai primer 225 và 226 sẽ hoạt động, khuếch đại các cDNA vừa tạo. Với nguyên tắc trên, phản ứng RT-PCR tối ưu sẽ được khảo sát dựa trên 5 chu trình sau Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát Chu trình nhiệt Giai đoạn 1 2 3 4 5 Tạo cDNA 45 o C/45’ 94 o C/2’ 45 o C/45’ 94 o C/2’ 45 o C/45’ 94 o C/2’ 45 o C/45’ 94 o C/2’ 45 o C/45’ 94 o C/2’ Khuếch đại cDNA 92 o C/30’’ 52 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 45 chu kỳ ) 92 o C/30’’ 54 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 45 chu kỳ ) 92 o C/30’’ 56 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 45 chu kỳ ) 92 o C/30’’ 58 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 45 chu kỳ ) 92 o C/30’’ 58 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 10 chu kỳ ) 92 o C/30’’ 54 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 35 chu kỳ ) Kéo dài 68 o C/8’ 68 o C/8’ 68 o C/8’ 68 o C/8’ 68 o C/8’ Trong đó chu trình 2 được thực hiện theo Sether (2001), các chu trình 1, 3, 4 chỉ thay đổi nhiệt độ bắt cặp ở giai đoạn khuếch đại cDNA của chu trình 2. 40 3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp Hỗn hợp hóa chất cần thiết cho một sản phẩm PCR (50 µ l) được pha như sau: Hóa chất Thể tích Nồng độ cuối AMV / Tfl Buffer (5X) 10 µ l 1X dNTP (10mM) 1 µ l 0.2 mM MgSO4 (25 mM) 2 µ l 1 mM Enzyme reverse AMV (5 Unit/ µ l) 1 µ l 0.1 Unit/ µ l Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/ µ l) 1 µ l 0.1 Unit/ µ l Primer 225 (25 mM) Primer 226 (25 mM) RNA khuôn mẫu 2 µ l Nước cất 2 lần 29 µ l Trong đó, nồng độ primer cho phản ứng được khảo sát ở 3 mức nồng độ cuối là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM. 3.2.3.4 Xác định số chu kỳ phản ứng tối ưu. Phản ứng RT-PCR được thực hiện ở 5 mức 41, 42, 43, 44, 45 chu kỳ để xác định số chu kỳ cho hiệu quả khuếch đại tối ưu. 3.3.4 Điện di sản phẩm RT-PCR Sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1.5% với hiệu điện thế 50V trong 90 phút. Quan sát kết quả điện di dưới đèn cực tím. Kích thước các sản phẩm PCR được ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder (Promega). Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 600 bp, tương đương với đoạn 589 bp trên lý thuyết, sẽ là những mẫu dương tính - bị nhiễm PMWaV-1. . trình sau Bảng 3. 1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát Chu trình nhiệt Giai đoạn 1 2 3 4 5 Tạo cDNA 45 o C /45 ’ 94 o C/2’ 45 o C /45 ’ 94 o C/2’ 45 o C /45 ’ 94 o C/2’. 3.2.3 .4 Xác định số chu kỳ phản ứng tối ưu. Phản ứng RT-PCR được thực hiện ở 5 mức 41 , 42 , 43 , 44 , 45 chu kỳ để xác định số chu kỳ cho hiệu quả khuếch đại tối ưu. 3.3 .4 Điện di sản phẩm RT-PCR. 94 o C/2’ 45 o C /45 ’ 94 o C/2’ 45 o C /45 ’ 94 o C/2’ Khuếch đại cDNA 92 o C/30’’ 52 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 45 chu kỳ ) 92 o C/30’’ 54 o C/1’ 68 o C/1’30’’ ( 45 chu kỳ )