1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cuộc sống ngày càng hiện đại, số lượng người bị các chứng béo phì và các bệnh về tiêu hóa cũng ngày một nhiều hơn. Đó là hậu quả của việc sử dụng “fast food” - thức ăn nhanh và những loại thực phẩm quá nhiều chất béo. Do đó, vấn đề đặt ra là cần phải có một loại thực phẩm năng lượng thấp, không lipid, lại giúp kích thích sự tiết thực để hạn chế phần nào các nguy cơ bệnh trên, mà vẫn phải thơm ngon, hấp dẫn đối với người tiêu dùng. Thạch dừa – Nata de Coco là một ví dụ. Thạch dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi trên môi trường nước dừa già, có thành phần chủ yếu là cellulose nên được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC). Thuận lợi của việc sản xuất thạch dừa theo phương pháp lên men truyền thống chính là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ… Tuy nhiên, điểm hạn chế của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, dẫn đến khó ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. Môi trường nước dừa già là nguyên liệu thường dùng để sản xuất thạch dừa nhưng chỉ có sẵn ở một số vùng (mang tính địa phương), còn những vùng khác lại rất khan hiếm do các yếu tố địa lí. Công tác vận chuyển nước dừa đến các vùng này cũng gặp rất nhiều khó khăn. Do đó, vấn đề đặt ra cần phải giải quyết là môi trường lên men phải xuất phát từ những nguồn nguyên liệu sẵn có, đa dạng, rẻ, có số lượng lớn, dễ vận chuyển và mang quy mô công nghiệp, không mang tính cục bộ, điạ phương, có thể tận dụng được phế phụ liệu từ các quá trình sản xuất thực phẩm khác. Xuất phát từ những yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài “Đa dạng hóa các môi trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum”. 2 1.2 Mục đích của đề tài - Tìm môi trường thay thế môi trường nước dừa già truyền thống để nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum - Tìm được công thức tối ưu nhất để sản xuất bacterial cellulose trên các môi trường thay thế. 1.3 Yêu cầu - Thuần khiết giống và giữ giống Acetobacter xylinum - Khảo sát và đánh giá sinh khối cellulose thô trên các môi trường: Nước dừa già (đối chứng) Nước ép dứa Nước cốt dừa - Khảo sát và đánh giá khả năng phát triển của Acetobacter xylinum khi thay đổi các thành phần bổ sung. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về thạch dừa Thạch dừa (Nata de Coco) là một loại thức ăn tráng miệng phổ biến, có nguồn gốc từ Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum, và là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ bacterial cellulose (BC). “Nata” là một từ Tây Ban Nha, xuất phát từ một từ Latin “Nata” có nghĩa là “nổi trôi” [Africa,1944]. Theo từ điển Bách khoa toàn thư mô tả thì Nata là “một khối cơ chất dày nổi trên bề mặt các loại môi trường”. Nata đã được nghiên cứu và mô tả bởi rất nhiều nhà khoa học từ năm 1949 – 1987. Trong số đó, định nghĩa của Sanger là rõ ràng và chính xác nhất: “Cellulosic có màu trắng đến vàng kem là cơ chất được hình thành bởi Aceti sp. xylinum trên bề mặt các loại môi trường có chứa đường như nước dừa, nước cốt dừa, dịch chiết thực vật, nước ép trái cây và các vật liệu phế phẩm khác” [Sanger, 1987]. Hình 2.1: Hình ảnh chung về Nata [29] 4 Bản chất của váng này là lớp màng hemicellulose bao quanh vi khuẩn, lớp màng này dày hơn rất nhiều so với kích thước tế bào. Hemicellulose là một loại polysaccaride được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao đổi chất trong môi trường nuôi cấy, chúng tích tụ đáng kể trong môi trường nhưng do không hoà tan trong nước (chỉ tan trong dung dịch kiềm - đồng amoni hydroxit) nên rất dễ tách ra khỏi môi trường nuôi cấy [Vương Thị Việt Hoa, 2000]. Thạch dừa không có giá trị dinh dưỡng cao nhưng tạo cảm giác ngon miệng nên là món ăn thú vị dùng tráng miệng và đặc biệt tốt đối với người đang ăn kiêng do nó không chứa các chất hóa học, chất bảo quản, chất tăng trưởng, lại giàu chất xơ, ít calories, không cholesterol. Ngoài ra, thạch dừa cũng rất có ích trong việc bài tiết của cơ thể do đặc tính kích thích nhu động ruột làm cho việc điều hòa bài tiết được tốt hơn. Vì thế, thạch dừa còn được xem như chất xơ tiết thực tối hảo. Chế phẩm từ dừa này còn là món ăn tuyệt diệu có tác dụng phòng ngừa ung thư, ngăn nguy cơ nghẽn mạch vành, nguy cơ tăng đột ngột lượng đường trong nước tiểu, giúp giữ làn da mịn màng, tươi trẻ [Trần Phú Hoà,1996]. 2.2 Đặc điểm của vi khuẩn acetic và vi khuẩn Acetobacter xylinum trong quá trình lên men tạo BC 2.2.1 Vi khuẩn acetic Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acetic, vì vậy nó còn được gọi là vi khuẩn acetic. Đây là loại vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập được từ dấm, rượu bia, hoa quả; từ không khí, đất, nước… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó nhiều loài có ý nghĩa về kinh tế [Nguyễn Lân Dũng, 1976]. 2.2.1.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn acetic là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước trung bình 0,6 – 0,8 m x 1 – 3 m. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành dạng chuỗi 5 dài. Một số loài đặc biệt có tế bào hình cầu, xoắn, chùy, hình chỉ hay hình bán nguyệt tùy thuộc điều kiện pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy. Vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử. Một số loài có thể di động nhờ tiên mao ở một đầu – đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này. Đây là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, bắt màu Gram âm khi còn non, khi già có thể đổi Gram. Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn, nhỏ, đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loài như A.aceti, A. xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh. Một số loài có khuẩn lạc lớn (d = 4 – 5 mm), bề mặt trơn bóng, không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường. Một số loài tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường nên khó lấy ra bằng que cấy. Trên môi trường lỏng, vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành những lớp màng dày, mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành lớp màng dày như sứa, nhẵn, trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Màng này có chứa sợi cellulose giống như sợi bông. Loại thứ hai có màng mỏng như giấy xelofan. Một số khác có màng không nhẵn mà nhăn nheo. Một số nữa tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong [Đinh Thị Kim Nhung, 1996; Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1975]. Hình 2.2: Vi khuẩn acetic [30; 35] 6 2.2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với các nguồn carbon, nitơ và các chất sinh trưởng rất đa dạng. Chúng sử dụng đường, rượu và các acid hữu cơ làm nguồn carbon, dùng muối amon làm nguồn nitơ [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003] Vi khuẩn acetic không những oxy hoá được rượu etylic thành acid acetic mà còn oxy hoá được rượu propylic thành acid propionic, rượu butylic thành acid butyric, nhưng chúng không oxy hoá được rượu metylic và các rượu bậc cao khác. Trong môi trường đủ rượu etylic (5 – 13%) thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid acetic, còn nếu nồng độ rượu thấp hơn thì các vi khuẩn acetic oxy hoá triệt để rượu thành CO 2 và H 2 O [Lương Đức Phẩm, 1998]. Vi khuẩn acetic có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Ngoài khả năng oxy hoá etanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B 1 , B 2 , oxy hoá được sorbit thành đường sorbose – dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hoá glycerin thành dioxyaceton, glucose thành acid gluconic. Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng hoá muối amon, khả năng phân giải pepton yếu. Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin như acid pantothenic, valin, alanin, prolin …, một số chất kích thích sinh trưởng như p – aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin… và một số chất khoáng K, Ca, Mg, Fe, S, P … ở dạng muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ. Do đó, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của Acetobacter [Trần Phú Hòa, 1996]. Vi khuẩn acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003]. Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của các loài vi khuẩn acetic là 20 – 30 0 C, pH tối thích là 5,5 – 6,2. Chúng có tính chịu acid cao, một số loài vẫn phát triển được ở pH = 3,2 [C.S. Pedeson, 1995]. 7 2.2.1.3 Phân loại vi khuẩn acetic Vi khuẩn acetic thuộc vào 2 giống chính: Acetobacter : có chu mao hoặc không Gluconobacter (còn gọi là Acetomonas) : đỉnh mao (đơn mao) Acetobacter và Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn acetic quan trọng nhất của họ Acetobacteriaceae. Gluconobacter không có chu trình ATC trong hoạt động tế bào nên không thể oxy hoá acetat (nhưng có chu trình glyoxylat thay thế). Ngược lại, Acetobacter có khả năng này [Đinh Thị Kim Nhung, 1996]. Những vi khuẩn này có nhiều điểm tương tự so với vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas. Chúng khác Pseudomonas ở chỗ chịu được độ acid cao hơn, khả năng chuyển hóa pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003]. Bảng 2.1: Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter (so sánh với Pseudomonas) Đặc điểm Acetobacter Gluconobacter Pseudomonas Tiên mao Chu mao hoặc không có Đỉnh mao hoặc không có Đỉnh mao Sinh trưởng ở pH = 4.5 + + - Oxy hoá: Etanol thành acid acetic Acid acetic thành CO 2 Lactat thành CO 2 Glucose thành gluconat + - - + + - + +/- - +/- + +/- Thủy phân tinh bột và lactose - - +/- Phân giải gelatin - - +/- Tạo sắc tố lục huỳnh quang - - +/- 8 Từ trước đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trong giống Acetobacter (Rothenbach - 1989, Beijerinch - 1899, Hoyer - 1899, Hansen - 1911, Janke - 1916, Vissert Hoft - 1925, Henneberg - 1926, Hermann - 1931, Vaughm - 1948) nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J – Frateur. Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa trên các tính chất sinh hoá cụ thể sau: Khả năng tạo catalase Khả năng tổng hợp các chất ceto từ những rượu bậc cao như glycerol, mannitol, sorbitol… Khả năng oxy hóa acetat thành CO 2 và H 2 O Khả năng oxy hóa glucose thành acid gluconic Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ trong môi trường Hoyer và sử dụng rượu etylic làm nguồn carbon Khả năng tạo sắc tố nâu Khả năng tổng hợp cellulose Trên cơ sở này, Frateur đã chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm: suboxydans, mesoxydans, oxydans, peroxydans. Nhóm Suboxydans gồm các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter melanogennum. Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và Acetobacter mesoxydans. Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất ceto: Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens. Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans, Acetobacter paradoxum không chứa catalase và không oxy hoá được glucose. [Đinh Thị Kim Nhung, 1996] 9 Bảng 2.2: Những khác biệt giữa các loài Acetobacter Đặc điểm tiên mao Chu mao Đỉnh mao Giống Acetobacter Glucono bacter Loài aceti xylinum mesoxy - dans lovani - ensis rances ascen - dens peroxy - dans para -doxum oxydans 1. Oxy hóa tiếp tục etanol thành CO 2 và H 2 O + + + + + + + + - 2. Catalase + + + + + + - - + 3. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer + - - + - - + - - 4. Chuyển hóa glucose thành acid gluconic + + + + + - - - + 5. Chuyển hóa glycerol thành dihydroxy – aceton + + + - - - - - + 6. Tổng hợp cellulose - + - - - - - - - 7. Tạo sắc tố nâu - - - - - - - - + [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003] 2.2.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Quá trình lên men acetic được coi là quá trình lên men dấm nhưng thực chất là một quá trình oxy hóa [Trần Phú Hòa, 1996]. A. xylinum là loài vi khuẩn tạo được BC nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [Brown và ctv, 1976]. 10 Theo khóa phân loại của Bergey, Acetobacter xylinum thuộc: Lớp : Schizomycetes Bộ : Pseudomonadales Bộ phụ : Pseudomonadiace Họ : Pseudomonadaceae Giống : Acetobacter [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004] 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, kích thước khoảng 2 m thay đổi tùy loài. Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí. Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric (do phản ứng của hemicellulose) [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]. Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH thấp hơn 5. Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng. Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh [Trần Phú Hòa, 1996]. A. xylinum có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm. Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, lúc còn non, A. xylinum phát triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt. Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy. . phát từ những yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài Đa dạng hóa các môi trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum . 2 1. 2 Mục đích của đề tài - Tìm môi trường. thay thế môi trường nước dừa già truyền thống để nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum - Tìm được công thức tối ưu nhất để sản xuất bacterial cellulose trên các môi trường thay thế. 1. 3 Yêu. Từ trước đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trong giống Acetobacter (Rothenbach - 19 89, Beijerinch - 18 99, Hoyer - 18 99, Hansen - 19 11, Janke - 19 16,