21 Đối với mỗi phương pháp khác nhau cần phải chọn những chủng vi khuẩn có đặc tính thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Nhưng chúng phải thỏa mãn một số yêu cầu sau:  Phải oxy hóa rượu tốt nhất và oxy hóa giấm thấp nhất.  Phải tạo ra giấm có chất lượng tốt (thơm, có nồng độ acid cao).  Chịu được độ rượu và acid cao.  Các tính chất ban đầu của chúng phải được giữ nguyên trong suốt quá trình.  Điều kiện nuôi cấy, phân lập và bảo quản giống đơn giản, không tốn kém. Do khảo sát nghiên cứu trên phương pháp nhanh, do đó cần yêu cầu chủng vi khuẩn phải tạo được màng mỏng tơi xốp, có độ bám dính cao, có độ bám dính cao, tích lũy và chịu được độ acid cao thì những giống hay dùng nhất là Actobacter Aceti, Acetobacter Schuitzenbachii… 1.6 Nguồn nguyên liệu sản xuất acid acetic Từ cơ chế quá trình lên men (xem phần 1.3.2) ta thấy bất cứ một sản phẩm nào có thể lên men rượu được đều dùng làm là nguyên liệu để lên men giấm. Nguyên liệu trong sản xuất giấm thường là các loại nước ép trái cây có đường, các loại siro có đường, sản phẩm thủy phân của các nguyên liệu chứa tinh bột, rượu vang, mạch nha, mật ong… Nếu dùng các sản phẩm chứa tinh bột thì phải qua hai khâu trung gian là chuyển hoá tinh bột thành đường nhờ enzyme amylaza của nấm mốc, rồi tiếp tục lên men rượu nhờ enzyme deareloxylaza của vi sinh vật, sau đó vi khuẩn giấm mới chuyển hóa rượu thành acid acetic. Nếu sản phẩm có đường thì không phải qua giai đoạn đầu. Trong công nghiệp sản xuất giấm, người ta thường dùng rượu cất pha loãng để lên men, yêu cầu rượu không có lẫn dầu fuzel, aldehyt … vì nó có tác dụng ức chế hoạt động sống của vi sinh vật, mà rượu có thể được lên men từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như ngũ cốc, rĩ đường,… 22 Hiện nay người ta dùng nước ép trái cây để lên men giấm sẽ có sản phẩm thơm ngon và có mùi đặc trưng phù hợp với yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm. Tuy nhiên, để duy trì các hoạt động sống bình thường của vi khuẩn thì trong thành phần của môi trường lên men phải có không những nước, rượu và acid acetic mà cả muối khoáng, gluxit và các chất có nitơ dể đồng hoá (muối amon). Lượng acid acetic tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn. Nói chung nguồn nguyên liệu để sản xuất giấm là phong phú và đa dạng. Mặc dù nguồn nguyên liệu có phong phú và đa dạng thì khi thực hiện quá trình lên men thành phần môi trường lên men cũng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau: Về thành phần cơ chất: rượu etylic hoặc những hợp chất có thể chuyển hoá thành rượu etylic (đường, tinh bột, …). Tuỳ từng chủng vi khuẩn sử dụng trong lên men mà hàm lượng rượu trong môi trường có thể thay đổi cho phù hợp. Thường hàm lượng rượu trong môi trường có thể thay đổi từ 4-13%. Về thành phần acid acetic: trong sản xuất người ta thường cho vào cơ chất ban đầu một lượng giấm nhất định để acid hoá môi trường nhầm mục đích:  Acid hoá môi trường để tạo pH thích hợp cho vi khuẩn giấm hoạt động.  Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại.  Đưa vào dịch lên men một lượng tế bào nhất định. Độ acid acetic ban đầu có thể dao động từ 2-6%. Theo nghiên cứu của Eapan và Rao năm 1979, hiệu suất cao nhất đạt được ở nồng độ acid ban đầu là 2%. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy để đạt hạm lượng acid cao hơn người ta tiến hành lên men ở nồng độ acid ban đầu cao hơn, khoảng từ 2- 6%. Về thành phần các chất dinh dưỡng như: C, H, O, N, P, S, …rất cần trong quá trình sống, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Các nguyên tố 23 này là thành phần chính của nguyên liệu xây dựng tế bào. Dựa vào hàm lượng tồn tại của chúng trong tế bào mà người ta chia chúng thành hai loại:  Nguyên tố khoáng đa lượng: C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg, …  Nguyên tố khoáng vi lượng: Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu,… Và một thành phần cũng rất quan trọng cần quan tâm đến đó chính là chất lượng nước pha môi trường trong quá trình lên men. Nước là thành phần cơ bản và thường được sử dụng với số lượng rất nhiều trong quá trình lên men. Do đó, chất lượng nước phải được bảo đảm để không xảy ra những phản ứng hoá học khi tiến hành lên men, hoặc không để xảy ra những tác động của vi sinh vật lạ từ nước vào quá trình lên men. Chất lượng nước phải được xem xét ở ba chỉ số sau:  Độ cứng  Khả năng oxy hoá.  Vi sinh vật, đặc biệt là những vi sinh vật gây bệnh. Vì thế, nước pha môi trường lên men phải đạt độ sạch sinh học cao (vô trùng) và hàm lượng Clo thấp. Mặc khác nguyên liệu lên men cũng phải được xử lý các hợp chất như: tanin, ligin, … nếu nguyên liệu là nước ép trái cây như: điều,dứa, … Vì thế nên khi thực hiện quá trình lên men thì thành phần môi trường phải đảm bảo các yêu cầu đã nêu trên cho dù sử dụng nguyên liệu lên men là: cồn, nước ép điều, dứa, nước dừa, dung dịch pha từ đường, … 24 1.7 Sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh 1.7.1 Các phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh: 1.7.1.1 Phương pháp nhúng: Hình 1.5 Thiết bị lên men nhanh bằng phương pháp nhúng Thiết bị lên men là một thùng thẳng đứng bên trong có một hay nhiều giỏ bằng gỗ đổ đầy phoi gỗ và có thể nâng lên hạ xuống được. Khi tiến hành lên men người ta đổ vào thùng khoảng ½ thể tích dịch lên men. Sau đó hạ giỏ xuống nhúng chìm lượng vỏ bào đã có màng vi khuẩn bám trong khối dịch lên men, để một thời gian nhất định để dịch lên men có thể thấm ướt toàn bộ lượng vật liệu bám thì nâng giỏ lên phơi trong không khí. Rồi lặp lại các thao tác đó theo môt chu kỳ nhất định, đã được tính toán trước sao cho quá trình oxyl hóa rượu đạt hiệu quả nhất. Tiến hành như vậy cho đến khi giấm hóa toàn bộ khối dịch lên men thì tháo ra để thanh trùng và bảo quản, rồi tiến hành mẻ khác. Phương pháp này có ưu điểm: đơn giản, dễ làm, gọn. Nhưng nó cũng có nhược điểm là năng suất thấp, dễ bị nhiễm khuẩn do không khí chưa được khử trùng. 1.7.1.2 Phương pháp dịch chuyển: Thiết bị lên men của phương pháp này gồm một thùng, bên trong có một cái phao và bên ngoài lắp với hai thùng phản ứng đặt bên cạnh thùng chính. Khi phao chứa đầy nước hay các vật liệu nặng khác, khối dịch lên men 25 chứa trong thùng chính bị ép phải dịch chuyển vào hai thùng phản ứng bên cạnh (có chứa đầy vỏ bào có vi khuẩn giấm bám trên bề mặt) khi những đệm chứa trong hai thùng phản ứng đã bảo hòa dịch lên men, phao được lấy ra và dịch lên men lại tràn về thùng chính. Phương pháp này đơn giản nhưng cồng kềnh, năng suất không cao, khó điều chỉnh quá trình nén chất lỏng từ thùng chính sang thùng phản ứng, không khí dễ bị nhiễm bẩn. 1.7.1.3 Phương pháp trống quay Hính 1.6 Thiết bị lên men nhanh bằng phương pháp trống quay Gồm một thùng hình trụ bên trong có cấu trúc sao cho nhận được một lượng không khí lớn nhất đối với vật liệu chứa trong đó. Trống được bao bọc trong thùng hình trụ lớn và kín, có chứa những lỗ hút không khí. Một nửa trống được tiếp xúc với không khí, còn phần còn lại nằm trong khối dịch lên men. Trống được quay với vòng quay thích hợp sao cho trong quá trình tiếp xúc không khí, các vi khuẩn giấm trên đệm có thể oxy hóa triệt để rượu có trong dịch lên men. 1.7.1.4 Phương pháp cố định: Trong phương pháp này thùng phản ứng (gọi là generator) là một thùng hình nón cụt thẳng đứng bằng gỗ (hoặc bằng một vật liệu nào đó chống ăn mòn) bên trong có tráng một lớp Parafin. Đồng thời có đổ đầy những vật liệu 26 bám có màng vi khuẩn giấm che phủ. Phần vật liệu này được giới hạn giữa hai đáy, đáy trên và đáy dưới cách khoảng 250mm có khoan những lỗ nhỏ để phân phối khí và lỏng. 1. Cửa đổ dịch lên men 4. Đĩa phân phối lỏng 2. Lưới đỡ đệm 5. Van hút không khí 3. Nhiệt kế 6. Cửa khí ra Hình 1.7 Thiết bị lên men nhanh phương pháp cố định (Generator thông khí tự nhiên) Ở đáy trên có những lỗ để tưới dịch lên men vào và cho không khí đi ra. Không khí được hút vào generator qua những lỗ nhỏ được khoan xung quanh dưới thành đáy giả. Để không khí vào mà lỏng không ra được thì các lỗ này được khoan dưới những góc nhọn với đường nằm ngang. Hai pha khí và lỏng đi ngược chiều nhau tiếp xúc trong generator sẽ được vi khuẩn chuyển hóa thành giấm. Nếu chiều cao generator đủ lớn thì dịch lên men chỉ cần đi qua một lần là được giấm hóa toàn bộ. Nếu quá trình lên men tốt, nhiệt độ ở phần làm việc của generator sẽ cao hơn ở nhiệt độ bên ngoài từ 10 – 12 0 C tạo điều kiện cho sự thông khí tự nhiên. Nhìn chung ba phương pháp đầu không được sử dụng rộng rãi trong sản xuất, chỉ có phương pháp cuối là phổ biến nhất và không ngừng được cải tiến, 27 do đó nó có những ưu điểm sau: năng suất tương đối lớn, thiết bị tương đối gọn nhẹ, có thể tiến hành sản xuất trong mọi điều kiện vì có sự thông khí tự nhiên nên không phụ thuộc vào nguồn điện. 1.7.2 Chất mang vi khuẩn acid acetic 1.7.2.1 Một số yêu cầu đối với chất mang vi khuẩn acid acetic: Bản chất của quá trình lên men giấm là quá trình hiếu khí, vì thế phải tạo điều kiện tối đa vi khuẩn tiếp xúc với oxy và cồn (rượu etylic). Trong phương pháp lên men nhanh, giá thể được dùng để tăng diện tích tiếp xúc của oxy với vi khuẩn giấm nhầm thúc đẩy quá trình lên men acid acetic và nâng cao chất lượng giấm. (Nguyễn Công Huân, 1985). Đây là một yếu tố quyết định tính hơn hẳn của phương pháp nhanh so với phương pháp chậm. Vấn đề này đã được nghiên cứu và sử dụng với nhiều loại vật liệu bám khác nhau, khi lựa chọn vật liệu bám cần căn cứ vào các yếu tố sau: - Thỏa mãn các yêu cầu chung của đệm như: nhẹ, có độ bền cơ học cao, diện tích tự do (bề mặt riêng) lớn, chống ăn mòn, rẻ tiền, dễ kiếm,… - Không phản ứng với dịch lên men, không khí và sản phẩm lên men, cũng như không tiết ra các hợp chất hóa học gây độc hại đối với vi sinh vật và mùi khó chịu cho giấm. - Đủ độ nhám và xốp để màng vi khuẩn có thể bám chặt ở một chế độ thủy động lực học nhất định. Dựa vào tính chất hóa học và nguồn gốc, chất mang được chọn để nghiên cứu là chất mang hữu cơ Celluloze. 1.7.2.2 Lựa chọn chất mang: Trong các loại chất mang thì chất mang có nguồn gốc celluloze có những ưu điểm phù hợp với điều kiện Việt Nam hiện nay như công nghệ gia công không phức tạp, rẻ tiền, dễ kiếm ( ví dụ như: tre, bã mía, gỗ sồi,…) 28 Trước đây, nhiều công trình đã nghiên cứu thử nghiệm với nhiều loại vật liệu bám chứa celluloze khác nhau như phôi gỗ (sồi, dẻ, bạch dương, ), lõi ngô, tre nứa,…Trong đó gỗ sồi được đánh giá rất cao vì nó có độ cứng tốt và trong các thớ gỗ có nhiều mao quản xốp. Nếu dùng gỗ sồi làm vật liệu bám thì được gia công như sau: gỗ được bào thành những lá mỏng, sấy khô bằng khí nóng và tự nó sẽ tạo thành những cuộn xoắn có độ xốp cao. Nếu dịch lên men từ rượu trắng và chế độ vận hành tốt thì phôi gỗ sồi có thể làm việc trong 20 – 30 năm, có khi đến 50 năm mới thay. Nếu dịch lên men từ nước ép quả, rượu vang thì chóng phải thay hơn do vi khuẩn Acetobacter tạo màng dày, bít chặt khoảng không gian tự do của các phôi bào. Ở Việt Nam không có gỗ sồi, còn họ dẻ ở nước ta có bảy loại thuộc họ dẻ đều có tính chất tương tự, dẻ gai có thể dùng làm vật liệu bám khá tốt. nhưng chúng có ít và phân bố rải rác khắp nơi các tỉnh Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ, nên khó khai thác và vận chuyển, khả năng sử dụng chúng rất thấp. Vì vậy, việc tìm kiếm và thăm dò các vật liệu bám có sẵn, dễ kiếm, rẽ tiền để thay thế cho gỗ sồi, đồng thời vẫn đảm bảo được các yêu cầu của vật liệu bám là một trong những vấn đề mấu chốt trong việc thăm dò phương pháp nhanh để sản xuất giấm ở Việt Nam. Vấn đề xử lý vật liệu bám cũng khá quan trọng nhằm tách các chất độc hại như: tanin, lignin, các loại tinh dầu,…thường hay có trong các vật liệu có nguồn gốc thực vật. Vì vậy cần xử lý cẩn thận vật liệu bám trước khi sử dụng, một trong những phương pháp hay làm trong công nghiệp là trích ly sơ bộ bằng nước nóng. Sau đó ngâm chúng trong dung dịch axit hay kiềm để trích ly triệt để hơn các chất đã nêu trên. Trên những yêu cầu đó chất mang được luận văn chọn nghiên cứu là thân cây tre. Vì ở Việt Nam, tre là loại cây dễ kiếm (có thể tìm thấy ở khắp nơi), rẽ tiền và rất dễ gia công. 29 1.7.3 Chuẩn bị cấy giống vào generator Đây là khâu quan trọng nhất quyết định sự thành công của quá trình lên men, nhờ khâu này mà vi khuẩn bám được trên bề mặt vật liệu đệm. Vật liệu bám đã được xử lý, chất đầy vào generator rồi thanh trùng Pasteur bằng hơi nước. Để cấy giống vi khuẩn lên bề mặt vật liệu bám người ta dùng giấm tươi (chưa lọc, chưa thanh trùng ) lấy từ một generator hiệu suất cao tuần hoàn chậm qua generator trong khoảng 8 – 12 h . Vào ngày thứ hai thêm vào một lượng rượu đủ để đưa hàm lượng rượu trong dịch khoảng 2 - 3% thể tích và lại tuần hoàn hỗn hợp trong 8 – 12 h . Ban đầu generator được cách ly với không khí bằng cách đóng chặt các van không khí để tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài do không khí. Sau ngày thứ hai generator được thông khí rất nhẹ cho đến khi vi khuẩn sinh sản trên bề mặt vật liệu bám (biểu hiện ở đây là khi nhiệt độ trong generator bắt đầu tăng so với bên ngoài do nhiệt phản ứng) generator sẵn sàng hoạt động. Chấm dứt giai đoạn cấy giống chuyển sang giai đoạn lên men. Thời gian tổng cộng của giai đoạn cấy giống đến 8 – 12 ngày đêm, ngoại lệ có thể nhanh hơn, nhưng có khi dài hơn. Lượng giấm tiêu hao cho quá trình cấy giống khoảng 400 l/m 3 vỏ bào. 1.7.4 Vận hành generator Trong thực tế sản xuất, người ta vận hành generator theo hướng khác nhau nhưng phổ biến nhất là trong ba hướng sau: 1. Vận hành đơn: Hỗn hợp dịch lên men chỉ đi qua generator một lần, trong kiểu vận hành này dung dịch ban đầu được acid hóa đến 3 – 3,5% acid. Dịch sau khi qua generator sẽ đạt nồng độ cỡ 6%. 2. Vận hành kép: Dịch lên men sau khi đi qua generator được acid hóa một phần và sẽ được giấm hóa hoàn toàn sau khi qua generator thứ 2, thứ 3,…đặt nối tiếp với generator đầu (đặt chồng lên nhau). 30 3. Generator tuần hoàn: Dịch lên men sau khi đi qua generator được bơm tuần hoàn liên tục qua generator cho đến khi được giấm hóa hoàn toàn. Trong loại này và vận hành kép dịch lên men ban đầu có thể không cần acid hóa hoặc chỉ acid hóa đến 1% acid. Các generator tuần hoàn được sử dụng rộng rãi nhất do nó có những ưu điểm sau: - Hoạt động với giá thành thấp - Tương đối đơn giản, dễ khống chế, điều khiển - Tiết kiệm nhiều không gian, để sản xuất cùng một lượng giấm, trong cùng một thời gian cần dùng ít đệm hơn Điều kiện cần thiết của phương pháp này là duy trì nhiệt độ trong buồng oxy hóa ở một giới hạn xác định đảm bảo cho quá trình tạo acid mạnh nhất (tốt nhất là giữ phần trên ở 30 0 C, phần dưới gần 33 – 34 0 C). Nhờ nhiệt độ này không khí bên ngoài không ảnh hưởng đến sự làm việc của generator do đó sản xuất không phụ thuộc vào thời tiết. Khi tuần hoàn có thể đưa generator luôn làm việc với nồng độ acid cao, như vậy một mặt tránh được sự tạp nhiễm có thể có (do thông khí tự nhiên), mặc khác luôn kích thích cho vi khuẩn phát triển và như vậy tốc độ tạo acid là rất cao, rút ngắn thời gian lên men. 1.7.5 Năng suất và hiệu quả của generator: Năng suất và hiệu suất là chỉ tiêu quan trọng đặc trưng cho sự làm việc của generator (và cũng chính là phương pháp nhanh sản xuất giấm). Năng suất của generator được xác định bằng lượng giấm (acid acetic 100%) nhận được từ 1m 3 vỏ bào (vật liệu bám) trong một ngày đêm. Ở các generator làm việc tốt có thể đạt 2,9 kg acid acetic/1m 3 vỏ bào. Hiệu suất lý thuyết theo cơ chế phản ứng là 103 kg acid acetic từ 100kg rượu khan. Nhưng thực tế ở các thiết bị lên men không có tháp ngưng tụ chỉ đạt 75 kg acid acetic mà thôi, còn các thiết bị ngưng tụ có thể đạt 93 kg acid . 24 1.7 Sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh 1.7.1 Các phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh: 1.7.1.1 Phương pháp nhúng: Hình 1.5 Thiết bị lên men nhanh bằng. 1.6 Nguồn nguyên liệu sản xuất acid acetic Từ cơ chế quá trình lên men (xem phần 1.3.2) ta thấy bất cứ một sản phẩm nào có thể lên men rượu được đều dùng làm là nguyên liệu để lên men giấm. Nguyên. hoá (muối amon). Lượng acid acetic tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn. Nói chung nguồn nguyên liệu để sản xuất giấm là phong phú và đa dạng. Mặc dù nguồn nguyên liệu có phong phú và đa