11 nhiên số lượng marker isozyme ít do đó không đủ để nghiên cứu toàn vẹn sự đa dạng di truyền, phân tích dựa trên kiểu hình nên dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường. Ứng dụng của marker isozyme đã được sử dụng thành công để nhận diện giống ở một số loài cây ăn trái như bơ ( Goldring và ctv, 1985), táo (Weeden và Lamb, 1985), xoài (Chemda Degani và Ruth EI-Batsri, 1990 - 1992). Đối với dứa, marker isozyme cũng đã được sử dụng để phân nhóm 161 dòng dứa dựa vào 6 enzyme (Aradhya M.K. và ctv, 1994). 2.3.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị (marker) phân tử Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho đời sau, giống như các nhân tố di truyền Meldel, nhưng lại có thể định lượng được. Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt được hai cá thể, hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem như là một marker DNA. Marker DNA có nhiều ưu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trường. Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài (thứ), phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Ahn et al., 1993; Dunforal et al., 1995). Chúng có thể được dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair et al., 1995; Zhang et al., 1995). Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004): - Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS - Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization- based): RFLP, minisatellite. 12 Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random amplified polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary primer-PCR DAF DNA amplification fingerprinting AFLP Amplified fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism SSR Simple sequence repeat (microsatellite) SSCP Single strand conformation polymorphism RFLP Restriction fragment length polymorphism STS Sequence-tagged sites Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lược được thế giới ủng hộ từ năm 1995, là phương pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu. Sau khi đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác của phương pháp (Bùi Chí Bửu, 2002). 2.3.3.1. Chỉ thị RFLP (RFLP marker) Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh năm 1980. Nguyên lý này dựa vào các đặc tính sau: - Tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất định của DNA (loại enzyme 6 cắt và 4 cắt). Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những trình tự nucleotide đặc trưng và tạo thành những đoạn có kích thước khác nhau. - Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương đồng với nó trên DNA genome. 13 Cụ thể nguyên lý của phương pháp này: DNA của genome sẽ được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn tạo ra những đoạn có kích thước khác nhau biểu hiện nhờ điện di trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng lai cellulose hoặc nylon. Quá trình lai diễn ra giữa DNA mục tiêu với các đoạn DNA thăm dò trên màng lai (probe) có gắn đồng vị phóng xạ. Kết quả của quá trình này được phát hiện nhờ những chất phát quang (fluorescens). Khi phân tích đa dạng di truyền, sự đa dạng của cá thể sẽ thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng. Chỉ thị RFLP đã được ứng dụng nhiều trong chọn giống và đa dạng di truyền ở thực vật. Chẳng hạn, Takashige Ishii và cs (1995) đã phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á qua sử dụng 12 probe DNA có kích thước từ 0,8 - 3,4 kb liên kết với các vùng của các nhiễm sắc thể từ số 1 - 12. Tương tự, Qifa Zang và cộng sự (1992) đã xác định được sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và japonica (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP. Ở Việt Nam, RFLP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng quần thể nấm đạo ôn miền bắc và miền trung Việt Nam ( Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1997) và còn được dùng trong phân tích đa hình DNA các giống lúa kháng, nhiễm bệnh đạo ôn (Nguyễn Trịnh Toàn và cs, 1997). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phương pháp này đòi hỏi số lượng và chất lượng DNA phải cao, tốn nhiều công sức, thời gian và đắt tiền (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). 2.3.3.2. Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction). Đây là một kỹ thuật ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng dụng chỉ thị phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn. Phương pháp PCR tạo nên ALP ( amplicon length polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể, các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di. Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả nhanh, không đòi hỏi sử dụng đồng vị phóng xạ, giá thành thấp, số lượng DNA ít. Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này đòi hỏi phải tổng hợp primer và Taq polymerase. Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primer) tương hợp với hai đầu 3‟ ở 14 cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence). Để primer được gắn vào DNA mục tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra. Đó là một chu kỳ của PCR. Do các sản phẩm mới được tổng hợp lại được dùng làm khuôn cho primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA lại được tăng gấp đôi so với chu kỳ trước đó. Chu kỳ gồm ba bước như trên được lập lại nhiều lần và tạo ra hàng triệu DNA trong vài giờ (Khuất Hữu Thành, 2003). Quy trình chuẩn của PCR được tiến hành như sau: - Bước 1:Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 94 0 C - 96 0 C trong vòng 30 giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu) - Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 - 72 0 C thường là 55 0 C và kéo dài từ 30 giây - 1 phút. - Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt độ tăng lên đến 72 0 C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt (Chien và ctv, 1976) và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại. Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lập lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tuỳ vào ứng dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72 0 C trong 5 phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 0 C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004). Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau: Tổng số khuếch đại = m x 2 n Trong đó n là số chu kỳ, m là số copy của chuổi mã hoá cần nghiên cứu. Giả sử chúng ta đạt hiệu quả là 100 %, sau 30 chu kỳ chúng ta sẽ có tổng số sản phẩm khuếch đại là 1,07*10 9 . Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR: - DNA polymerase: được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Themus aquticus, có tính ổn định nhiệt rất cao. Trong hầu hết các protocol, người ta khuyến cáo nồng độ Taq sử dụng là 0,5 U / 25 µl. Nếu nồng độ Taq quá cao (> 1,25 U / 25 µl, 15 những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004). - Primer và dNTP Dung dịch dNTP làm stock phải được trung tính ở pH=7.0 và tồn trữ ở -20 0 C. Stock được dùng nên có nồng độ dNTP là 1mM. Sự ổn định của dNTP trong suốt các chu kỳ lập lại ước còn khoảng 50 % sau 50 chu kỳ (Innis và ctv, 1990). Hàm lượng dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính. Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó. Sự khuếch đại chuyên biệt đối với DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc các primer tương xứng. Do vậy, chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nếu có 50 % G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 - 20 nucleotide và có tính đặc hiệu hơn, còn đối với primer chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tính đặc hiệu. - DNA mục tiêu Người ta cần phải có những đoạn DNA mang mật mã biết trước, được gọi với thuật ngữ “ target DNA” (DNA mục tiêu) trong kỹ thuật PCR. Kết quả thu nhận sẽ tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá. Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì lượng này là 5 – 25 ng DNA.  Chỉ thị RAPD (RAPD marker) Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer tương ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỹ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990 và Welsh et al., 1991). Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng 16 một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9-12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có ngàn hàng loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phương pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0.3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana, là 0.5 / 1primer ở cây đậu tương, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000). Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bước như sau: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR. - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid. - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.)., lập dendrogam. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau: 17 - Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni et al., 1996; Winter et al., 1995). - Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể. - In dấu vân tay (DNA fingerprinting). - Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau: - Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử - Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất - Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu. - Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân. Hình 2.1: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền.  Marker AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) – đa dạng chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc, là phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR. Ở đây sản phẩm PCR là kết quả của quá trình nhân bội các đoạn DNA sau khi đã được cắt bằng enzyme giới hạn (Zabow M. Và Vos P.,1993). Nguyên lý của kỹ thuật này như sau: trước khi làm phản ứng PCR người ta gắn các đoạn DNA ngắn (adaptor) vào hai 18 đầu của mảnh DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn sau đó thiết kế các primer theo các đoạn DNA ngắn có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng PCR. Khi thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau. Sản phẩm được phân tích trên gel polyacrymide, kết quả thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu thí nghiệm. Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào (Zabeau, 1993) do đó được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di truyền ở cây trồng như lúa, lạc (Redona et al., 1998; He et al., 1997). Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành đắt nên phần nào hạn chế sử dụng.  Marker SSR ( Microsatellite marker) Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất nhạy cảm (Ramakrishna và ctv, 1995). Được gọi với thuật ngữ chuỗi mã đơn giản lập lại nhiều lần (Simple sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp. Do đó SSR có thể khuếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer theo miền của 2 bên trên một locus. Kết quả dựa vào độ dài và số lượng của các đoạn lập lại DNA khác nhau giữa các động vật, thực vật và vi sinh vật để xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so sánh. Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa hình rất cao và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhược điểm của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài. Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Parasnis (1998) phát hiện đoạn lập lại GATA kích thước 5 kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR. Ngoài ra, microsattelitte marker cũng được dùng để phân tích tính đa dạng nguồn gen cây có múi (Trần thị Oanh Yến và ctv, 2003). 19 2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền trên Thế Giới và Việt Nam 2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với nhu cầu thị trường. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã được thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại chỉ thị phân tử nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những thành công được thể hiện qua những nghiên cứu sau: - Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv, 1992). Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius). Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A. ananassoidies với mức tương quan của A. comonus (0.398) và A.ananassoidies (0.381). Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến. - Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001) đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai. - Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống (dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác biệt với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi trường, tỉ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma. - Xác định độ tin cậy kiểu gen của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003). - Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001). - Ngoài ra, các nghiên cứu về sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác như cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, dâu tây, khoai tây, cà chua cũng đã có nhiều báo cáo thành công. 20 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen , sử dụng kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR… Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều nhưng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng. Dưới đây là một số nghiên cứu đã ứng dụng thành công trên nhiều loại cây trồng như: - Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Ctv, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm được 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc. - Khảo sát tính đa hình trên cây cà chua bằng chỉ thị RAPD (Thái kỳ Tài và ctv, 2004). - Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD (Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003). - Phân tích sự đa dạng di truyền của giống đậu nành bằng marker phân tử (Phạm Thị Bé Tư, Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2003). Kết quả 50 giống đậu nành đã được phân thành 5 nhóm chính thông qua 17 primer và phân tích dựa trên UPGMA . - Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa (Bùi chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Đức thành và ctv, 1999). - Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (Đỗ Đức Tuyến, 2000). - Nghiên cứu tính đa dạng di truyền trên 17 giống dưa leo dựa vào kỹ thuật RAPD (Phan Lê Diệu Phương, 2003). . thể hiện qua những nghiên cứu sau: - Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv, 19 92) . Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus. bằng marker SSR. Ngoài ra, microsattelitte marker cũng được dùng để phân tích tính đa dạng nguồn gen cây có múi (Trần thị Oanh Yến và ctv, 20 03). 19 2. 4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker. thành công. 20 2. 4 .2. Nghiên cứu ở Việt Nam Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen , sử dụng