7 Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lượng MDA tính theo công thức: X = E x 30,8 Trong đó: X = hàm lượng MDA; E = độ hấp thu ở 532 nm; 30,8 = hệ số tắt phân tử. Kết quả: Kết quả đo MDA trong gan chuột được trình bày ở bảng II.3 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng Lô Thí nghiệm n (số chuột) E TB MDA TB 1 Đối chứng 8 0,163 5,0296 2 Gây mô hình viêm gan, không dùng thuốc Xuân Hoa. 12 0,458 14,1156 3 Gây mô hình viêm gan, có dùng thuốc Xuân Hoa. 8 0,348 10,7091 Như vậy ở lô uống cao toàn phần Xuân Hoa hàm lượng MDA có giảm so với mô gây mô hình (giảm từ 14,1156 xuống còn 10,7091) + Hàm lượng men gan quá cao (AST, ALT), không đo được trên máy. + Xét nghiệm vi thể: chưa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do tác dụng điều trị của thuốc. Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng Lô Thí nghiệm n (số chuột) E TB MDA TB 1 Đối chứng 8 0,1915 5,8982 2 Gây mô hình viêm gan, không dùng thuốc Xuân Hoa. 12 0,385 11,547 3 Gây mô hình viêm gan, có dùng thuốc Xuân Hoa. 8 0,203 6,2463 Kết quả cho thấy lô có uống cao toàn phần lá Xuân Hoa hàm lượng MDA có giảm so với lô gây mô hình (giảm từ 11,547 xuống còn 6,2463). Xác định hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng: 8 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng: Lô n (số chuột) AST (U/I) ALT (U/I) 1 8 270 432 2 12 9668 10878 3 8 8740 10533 Hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể. Xét nghiệm vi thể: lô chuột được uống cao toàn phần lá Xuân Hoa và gây mô hình, nhận thấy vùng hoại tử xung quanh tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ vẫn tồn tại, các tế bào ở các vùng thoái hóa đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hướng hồi phục. Kết luận: ở liều gây ngộ độc gan 1 ml CCl 4 /kg thể trọng, gan chuột bị hoại tử nặng, các giá trị AST, ALT tăng lên quá cao, không đọc được trên máy, nhưng hàm lượng MDA có giảm rõ rệt từ 14,1156 xuống còn 10,7091 và chưa thấy có dấu hiệu bình phục của tế bào gan. Với liều gây độc 0,5 ml/kg thể trọng, hàm lượng MDA cũng giảm rất rõ rệt, từ 11,574 xuống còn 6,2463, hàm lượng men gan cũng giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục của gan. Như vậy có thể sơ bộ kết luận: cao đặc toàn phần lá cây Xuân Hoa có tác dung ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hướng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm. Năm 2004, Huỳnh Kim Diệu và Trần Văn Hòa đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang được sử dụng trị bệnh tiêu chảy heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lượt: Bột Xuân Hoa 92,86 %; Coli- norgen 90,48 %; Cotrimxazol 83,33 %. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14 %; 9,52 %; 14,29 %. Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với 2 loại kháng sinh Coli-nogen và Cotrimxazol Loại thuốc Số heo thử nghiệm Số luợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Số con % Số con % Số con % Bột Xuân Hoa 42 10 23,81 29 69,05 39 92,86 Coli- norgen 42 10 23,81 25 59,52 38 90,48 Cotrimxazol 42 15 35,71 28 66,67 35 83,33 9 Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân heo bệnh sau khi điều trị cho thấy tác nhân gây bệnh là E. coli, không tìm thấy tác nhân gây bệnh khác như: Salmonella, Proteus và Pseudomonas. Ngoài ra Huỳnh Kim Diệu và cộng sự còn tiến hành thử nghiệm độc tính của cây Xuân Hoa trên chuột cho thấy: Không xác định được LD 50 : kết luận lá Xuân Hoa không có độc tính cấp diễn. Thử độc tính bán trường diễn: Sau 60 ngày tác động thuốc các chỉ tiêu sinh lý máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu bình thường. Và các chỉ số sinh hoá của gan và thận: SGOT, SGPT, Bilirubin toàn phần, Creatinin không khác biệt so với lô đối chứng. Tiến hành giải phẩu bệnh lý chức năng gan và thận: khảo sát vi thể nhận thấy mô gan và thận bình thường, không có hiện tượng hủy hoại tế bào gan và thận. Như vậy lá Xuân Hoa không gây độc tính bán cấp. 2.2. Vi khuẩn đƣờng ruột [3],[12] 2.2.1.Đại cƣơng về họ vi khuẩn đƣờng ruột 2.2.1.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi; không có men oxidase; len men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không; khử nitrat thành nitrit; có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân; không sinh nha bào. 2.2.1.2. Hình thể Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-). Kích thước trung bình 2 - 4 μm x 0,4 - 0,6 μm. Một số loài hình thể không ổn định,có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không bao giờ sinh nha bào. Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường. 2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trong môi trường lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường; có thể phát triển thành váng trên bề mặt; nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy ống. 10 Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc: - Dạng S: khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. - Dạng R: mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng. - Dạng M: hình thức phát triển này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lac dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau. 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hoá học Những tính chất sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: - Di động hoặc không di động. - Lên men hoặc không lên men một số loại đường. Hai loại thường được xác đinh nhất là glucose và lactose. - Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường. - Có hay không có một số enzym. Hai enzym thường được xác định nhất là urease và tryptophanase. - Khả năng sinh ra sunfua hydro (H 2 S) khi dị hoá protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh. - Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp, ví dụ khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons. Dựa vào tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột, ta có thể loại trừ hoặc xếp một vi khuẩn nào đó vào họ này. Ngoài các tính chất đó, nhiều tính chất sinh vật hóa học khác cũng được dùng để phân loại Enterobateriaceae 2.2.1.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng sinh nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hoá lý đặc biệt của môi trường. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100 0 C và bởi các hóa chất sát khuẩn thông thường. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 11 2.2.1.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố. Bản chất hóa học của nội độc tố là lipopolysaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị li giải. Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100.000 đến 500.000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhưng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị tích cực kịp thời, dể chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100 0 C trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốt. Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngọai độc tố như S.shiga, E.coli loại ETEC (enterotoxigenic E.coli). Ngoại độc tố của S.shiga làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều; ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. - Kháng nguyên O: Kháng nguyên O là kháng nguyên thân của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Kháng nguyên O là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên; poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc. Kháng nguyên O không bị phá hủy ở 100 0 C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẻ xãy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để 12 phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh. - Kháng nguyên H: Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Kháng nguyên H có bản chất là protein, dể bị phá huỷ ở 100 0 C hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xãy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thàng không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. - Kháng nguyên K: Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt. kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.typhy). Kháng nguyên K, nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra được khang nguyên này. 2.2.1.8. Phân loại Vấn đề phân loại của Enterobacteriaceae đã từng được tranh luận rất nhiều. ngoài cách phân loại của Bergey có ba cách phân loại khác: Cách phân loại của tiểu ban về Enterobacteriaceae thuộc Hội Vi sinh học quốc tế, năm 1958, chia họ này thành 12 giống. 13 Cách phân loại của Kauffmann, năm 1966, chia Enterobateriaceae thành 3 tộc và 12 giống. Cách phân loại của Ewing, năm 1986, chia Enterobacteriaceae thành 8 tộc và 14 giống.Nhiều tác giả cho rằng cách phân loại của Ewing là hợp lý hơn vì nó giúp ích nhiều trong chuẩn đoán vi sinh vật và trong nghiên cứu dịch tể học. Dưới đây là sơ đồ phân loại họ Enterobacteriaceae của Ewing. Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột Tộc I: Escherichieae Giống I: Escherichia. Giống II: Shigella. Tộc IV: Citrobactereae Giống I: Citrobacter Tộc VII: Yersinieae Giống I: Yersinia Tộc II: Edwardsielleae Giống I: Edwardsiella Tộc V: klebsielleae Giống I: Klebsiella Giống II: Enterobacter Giống III: Hafnia Giống IV: Serratia Tộc VIII: Erwinieae Giống I: Erwinia Tộc III: Salmonelleae Giống I: Samonella Tộc VI: Proteeae Giống I: Proteus Giống II: Morganella Giống III: Providencia 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiểu cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp… Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. Bệnh lý ở các mô, các cơ quan khác nhau có thể là hậu quả của bệnh lý đường tiêu hoá, có thể song hành với bệnh lý ở đường tiêu hóa, nhưng cũng có thể chỉ biểu 14 hiện bệnh lý ở một cơ quan nào đó trong khi đường tiêu hóa vẫn hoàn toàn bình thường. 2.3. Salmonella [3],[12],[27] Mặc dù hiện nay người ta đã biết đến mấy chục loài đến hàng nghìn typ huyết thanh khác nhau thuộc giống Salmonella, S.typhi vẫn là loài được quan tâm nhiều nhất không những bởi vai trò gây bệnh của nó mà vì nó gắn liền với những mốc lịch sử quan trọng trong quá trình nghiên cứu về Salmonella nói chung và bệnh thương hàn nói riêng. Bệnh thương hàn đã được biết đến từ rất lâu. Y văn thế giới ghi nhận sự mô tả về bệnh này lần đầu tiên vào năm 1820 của Bretoneau. Năm 1880, Grafky đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản làm từ hạch của bệnh nhân bị chết vì bệnh thương hàn và ông cũng là người đầu tiên phân lập được S.typhi vào năm 1884. Năm 1896, Widal chứng minh rằng huyết thanh của bệnh nhân thương hàn có khả năng ngưng kết S.typi. Đây là cơ sở cho phương pháp chuẩn đoán huyết thanh học. Năm 1917, Felix đã mô tả kháng nguyên thân và kháng nguyên lông của Salmonella, đặt cơ sở cho phương pháp phân tích kháng nguyên của vi khuẩn. Năm 1935, Reilly đã nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của bệnh thương hàn. Ông chứng minh rằng hệ thần kinh thực vật có vai trò trong việc gây ra những tổn thương ở ruột. 2.3.1. Đặc điểm sinh học 2.3.1.1. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 μm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), rất di động, không có vỏ, không sinh bào tử. 15 Hình 2.2: Salmonella typhimurium 2.3.1.2. Tính chất nuôi cấy Có khả năng phát triển trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Rất dễ nuôi cấy, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37 0 C nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ 6 0 C – 42 0 C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9. Trên môi trường lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ môi trường đục đều. Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, thường không màu hoăc màu trắng sáng. Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng; trên môi trường Istrati khuẩn lạc có màu xanh. 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học Không lên men lactose (loài S.arizona lên men lactose chậm). Lên men đường glucose thường sinh hơi (trừ S. typhi). Sử dụng được citrat ở môi trường Simmons (trừ S. typhi và S. paratyphiA). Catalase (+), oxidase (-), urease (-). Lysin decarboboxylase (+) (trừ S. paratyphi A). ONPG (-), RM (+), VP (-). H 2 S (-) (một số chủng trong loài S. paratyphi A có khả năng sinh H 2 S). 2.3.1.4. Sức đề kháng Có thể tồn tại trong nước 2 – 3 tuần, trong phân 2 – 3 tháng. Trong nước đá có thể sống được 2 – 3 tháng. . Các thành vi n của họ vi khuẩn đường ruột không bao giờ sinh nha bào. Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường. 2.2.1 .3. Tính chất nuôi cấy Các thành vi n của họ vi. Giống III: Providencia 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng. Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng