25 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp Bệnh phẩm khác nhau tùy từng bệnh: - Phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hoá. - Nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu. - Máu nếu là nhiễm khuẩn máu… Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy. Phương pháp chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm được nhân lên trên môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên thạch thường. Máu được cấy vào canh thang. Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa học và định loại bằng kháng huyết thanh mẫu. Đối với viêm màng não, hiện nay người ta còn tiến hành phương pháp chuẩn đoán nhanh và đặc hiệu bằng kỹ thuật ngưng kết lactex để xác định kháng nguyên trong dịch não tủy. 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp Trên thực tế chuẩn đoán gián tiếp không được sử dụng trong chuẩn đoán các nhiễm khuẩn do E. coli. 2.4.4. Phòng bệnh Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm khuẩn đường tiêu hóa do E. coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác. 2.4.5. Chữa bệnh E. coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là chủng phân lập được từ nước tiểu, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp. Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị như bồi phụ nước, điện giải trong trường hợp tiêu chảy (việc này nhiều khi có vai trò quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết những cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thông sớm nếu có thể được… 26 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Nguyên liệu Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum). Bộ phận dùng : lá. Thu hái tại vườn thực vật ĐH Cần Thơ. 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Tiến hành thí nghiệm phân tích thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 7/2004, tại Phòng Hóa Lý- Trung Tâm Phân Tích ĐHNL và Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao được điều chế từ lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 4/8/2005 đến 26/8/2005. Thực hiện tại phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Khoa Công Nghệ Môi Trường. 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết  Hóa chất dùng cho phân tích thành phần hóa học - Ete dầu hỏa: chưng cất phân đọan < 90 0 C. - Etylacetat: chưng cất phân đoạn ở 64 - 65 o C, làm khan bằng Na 2 SO 4 . - Chloroform: chưng cất phân đoạn ở 60 - 61 o C, làm khan bằng Na 2 SO 4 . - Ethanol : chưng cất phân đoạn ở 78 o C, làm khan bằng Na 2 SO 4 . - Nước cất hai lần. - Thuốc thử hiện hình: H 2 SO 4 10 % / C 2 H 5 OH, đèn UV 254nm. - Hạt silicagel dùng cho sắc ký cột: kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm, dùng lượng silicagel gấp 30 lần lượng cao, hoạt hóa ở 110 0 C trong 30 phút trước khi sử dụng. - Bản mỏng silicagel loại 25 DC - alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F 254 , Merck. - Na 2 SO 4 , Na 2 CO 3 , FeCl 3 . 27 - Mg kim loại. - Natri acetat. - H 2 SO 4 10%, H 2 SO 4 1%, H 2 SO 4 đđ , HCl đđ. - Thuốc thử: Liebermann, Fehling, Mayer, Bouchardat, Bertrand, Bouchardat, Dragendorff  Hóa chất dùng cho thử nghiệm vi sinh - H 2 SO 4 1 %, BaCl 2 .2H 2 O. - Dung môi DMSO (dimethysulfoside). - Nước cất. - Môi trường lỏng BHI. - Agar. - Cồn 96 0 , cồn 70 0 . 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm  Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng cho thí nghiệm phân tích thành phần hóa học lá Xuân Hoa - Bộ soxhlet 6 chỗ (Đức). - Bộ chưng cất dung môi (Việt nam). - Máy cô quay hiệu Buchi (Đức) - Tủ sấy (Memmert). - Bếp hồng ngoại (Scott, Đức). - Bình lắng (Duran, Đức). - Ống chạy sắc ký cột kích thước 5 x 100 cm và 2,5 x 40 cm. - Điểm nóng chảy xác định trên máy BUCHI melting point - B545. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BURKER - IFS48 - Carlo Erba - GC 6130. - Phổ 1 H-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 500 MHz tại Viện Hóa học, Hà Nội. - Phổ 13 C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 125 MHz tại Viện Hóa học, Hà Nội.  Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm cần cho thử nghiệm vi sinh - Tủ cấy vô khuẩn (Nuaire). 28 - Autoclave (Tomy SS – 325). - Tủ ấm (Memmert). - Cân điện tử (Sartorius). - Bếp điện (Airlux). - Pipette loại 100 – 1000 μl. - Đầu tipe loại 1000 μl. - Ống nghiệm. - Que cấy trang, que cấy vòng. - Đèn cồn 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Xử lý nguyên liệu [19],[20] Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khô, sấy khô đến trọng lượng không đổi sau đó xay thành bột. 3.2.2. Xác định độ ẩm -Nguyên tắc : Mẫu được sấy ở 105 0 C nước sẽ bốc hơi và làm giảm khối lượng. Cân rồi suy ra độ ẩm. -Tiến hành : sấy trong chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu sấy ở 105 0 C trong 2 giờ, sau đó lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đó cân thu khối lượng còn lại (a g) và tính độ ẩm mẫu theo công thức:. Độ ẩm mẫu = (10 - a ) x 100 % 3.2.3. Xác định tro toàn phần Tro toàn phần là lượng hợp chất vô cơ còn lại khi nung cháy hoàn toàn mẫu nguyên liệu, các ion còn lại ở dạng carbonat hay oxit. - Tiến hành : Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lò nung ở nhiệt độ 600 0 C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro còn lại (b g) và tính hàm lượng tro theo công thức: Hàm lượng tro = b/10 x 100 % 29 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật [6],[16],[20],[22] 3.3.1. Nguyên tắc Dựa vào độ hòa tan trong các dung môi khác nhau của các hợp chất trong nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethanol và nước. Sau đó xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. 3.3.2. Cách tiến hành Chuẩn bị dịch chiết: - Dịch chiết ether: Chiết 25 g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50 ml. - Dịch chiết cồn: Bã sau khi chiết bằng ether được chiết nóng bằng cồn 96 0 trong bể siêu âm đến khi dịch gần không màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50 ml. - Dịch chiết nƣớc: Bã sau khi chiết bằng cồn 96 0 , đem chiết nóng trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đủ ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml. Xác định các nhóm hợp chất: Xác định các nhóm hợp chất trong dịch ether: Chất béo Anthraglycosid Triterpenoid tự do Alkaloid Flavonoid Coumarin Tinh dầu Carotenoid Acid hữu cơ Xác định các nhóm hợp chất trong dịch cồn: Alkaloid Antraglycosid Tanin Đường khử Flavonoid Saponin 30 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch nƣớc: Alkaloid Antraglycosid Saponin Flavonoid Tanin Polyuronic Đường khử Phương pháp định tính: Acid hữu cơ: Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha loãng với 1 ml nước cất, thêm một ít tinh thể NaCO 3 . Nếu có bọt khí sủi lên từ các tinh thể NaCO 3 - Có acid hữu cơ. Alkaloid: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lượt vào đó các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là có alkaloid: Thuốc thử Valse-Mayer: Tủa trắng – vàng nhạt Bertrand : Tủa trắng Bouchardat : Tủa đỏ nâu Dragendorff : Tủa đỏ cam Antraglycosid: Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ - Có anthraglycosid. Carotenoid: Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đó vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl 3 bão hòa trong CHCl 3 ). Dung dịch có màu đỏ - Có carotenoid. Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H 2 SO 4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương - Có carotenoid. Chất béo: Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có). Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Có chất béo. 31 Đƣờng khử: Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử). Coumarin: Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đó hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết chấm bằng một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa không bị che – có coumarin. Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hòa cắn với 2 ml cồn 70 0 , chia đều vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai - có coumarin. Flavonoid: Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô. Hòa cắn với 2 ml cồn 25 0 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào đó một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch có màu từ hồng tới đỏ - có flavonoid. Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl 10 %, nếu dung dịch có màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10 % - Có anthocyanosid. Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl 10 %, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ - có proanthocyanidin. Polyuronic: Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 95 0 . Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành - có polyuronid. 32 Saponin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa cắn với 5 ml cồn 25 0 trên bếp cách thủy. Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền - có saponin. Tanin: Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm: Ống 1: Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl 3 5 %, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh rêu hay xanh đen - có polyphenol. Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng. Nếu có tủa bông trắng - có tanin. Tinh dầu: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn có mùi thơm nhẹ cho vào đó một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng – có tinh dầu. Triterpenoid: Phản ứng Libermann-Burchard: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hòa cắn với 0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl 3 , chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml H 2 SO 4 đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vòng ngăn cách có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - có triterpennoid tự do (phytosterol). 33 Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật FeCl 3 TT Fehling A, B Nguyên liệu Mg/HClđđ Chiết bằng ether Bã nguyên liệu Dịch Ether KOH 10% Chiết bằng cồn Lớp kiềm Lớp ether Dịch chiết cồn Bã nguyên liệu Dịch cồn Dịch ether Dịch acid Bã nguyên liệu Dịch acid H2SO4 10% vết trên giấy lọc KOH 10% Flavonoid Acid béo Anthraglycosid Cắn có mùi thơm Liebermann H 2 SO 4đđ Tinh dầu Phytosterol Carotenoid TT Mayer, Bouchardat, Dragendoft Alkaloid KOH, HCl TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na 2 CO 3 Na Acetat + FeCl 3 3% Mg/HCl đđ KOH 10% Liebermann Anthraglycosid Sterolic Flavonoid Tanin Acid hữu cơ Alkaloid Đường khử Anthocyan Saponin Tạo bọt Cồn cao độ TT Mayer, Bouchardat H2SO4 1% H/c uronic Đường khử Tanin Alkaloid Saponin . vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là chủng phân lập được từ nước tiểu, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp. Ngoài vi c sử dụng kháng sinh, một số vi c khác rất có. Phòng Hóa Lý- Trung Tâm Phân Tích ĐHNL và Phân Vi n Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao được điều chế từ lá Xuân Hoa. Thời. 4/8/20 05 đến 26/8/20 05. Thực hiện tại phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Khoa Công Nghệ Môi Trường. 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết  Hóa chất dùng cho phân tích thành phần hóa học - Ete dầu hỏa: