28 Bảng 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 146 100 98,6 2 39 146 39 143 100 97,9 3 42 147 42 143 100 97,3 4 40 143 40 142 100 99,3 Trung bình 100 98,3 Bảng 4.3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 143 100 95,3 2 34 146 34 141 100 96,6 3 36 147 36 143 100 97,3 4 34 143 34 138 100 96,5 Trung bình 100 96,4 29 Bảng 4.4. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 140 100 94,6 2 39 146 39 135 100 92,5 3 42 147 42 138 100 93,9 4 40 143 40 137 100 95,8 Trung bình 100 94,2 Kết quả ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy sau thanh lọc lần 1 thì hầu hết các mẫu đối chứng đều sống sót và hình thành mô sẹo (100%). Ở các mẫu lây nhiễm tỉ lệ này cũng khá cao. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo của giống Coker 312 sau thanh lọc lần 1 là 97,6% còn đối với giống VN36P thì tỉ lệ này là 98,3% sau khi thanh lọc lần 1. Sau khi thanh lọc lần 2 thì mẫu đối chứng vẫn sống sót và hình thanh mô sẹo với tỉ lệ 100% còn ở mẫu lây nhiễm tỉ lệ này có giảm nhưng rất nhỏ. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 của giống Coker 312 là 96,4% và của giống VN36P là 94,2% (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). Tỉ lệ sống sót cao trong lần thanh lọc 1 và 2 có thể do còn có một lượng đường glucose trong môi trường (1% và 0,5%). Các mẫu cấy có thể đã sử dụng lượng đường này làm nguồn dinh dưỡng. Riêng ở mẫu lây nhiễm có một số mẫu bị chết có thể là do bị tổn thương khi ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa bằng nước cất, kháng sinh trong quá trình lây nhiễm và cũng có thể do thao tác thí nghiệm khi chuyển mẫu. 30 Bảng 4.5. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 32 34 84,2 22,7 2 34 146 30 33 88,2 22,6 3 36 147 32 35 88,9 23,8 4 34 143 28 32 82,4 22,4 Trung bình 85,9 22,9 Bảng 4.6. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 37 36 88,1 24,3 2 39 146 33 33 84,6 22,6 3 42 147 35 32 83,3 21,8 4 40 143 36 31 90,0 21,7 Trung bình 86,5 22,6 Sau khi thanh lọc lần 3, số mẫu còn sống khá cao ở các đối chứng (85,9% đối với Coker312 và 86,5% đối với VN36P), còn ở mẫu lây nhiễm số mẫu còn sống là rất ít, trên giống Coker 312 là 22,9% còn trên giống VN36P là 22,6 (Bảng 4.5 và Bảng 4.6). Trên môi trường lần 3 không có đường glucose chỉ có đường mannose mà tỉ lệ mẫu đối chứng còn sống rất cao có thể là do trong các khối mô sẹo có sự tích lũy đường glucose, trong khi đó tỉ lệ mẫu sống và hình thành mô sẹo ở mẫu lây nhiễm lại thấp. Với việc các mẫu đối chứng còn sống chúng ta không thể cho rằng các mẫu lây nhiễm còn sống là các 31 mẫu được chuyển nạp gen cũng như đánh giá được sự khác biệt giữa hai giống Coker312 và VN36P về khả năng chuyển nạp gen. Sau 3 lần thanh lọc, số mẫu đối chứng sống sót cao có thể là do các khối mô sẹo có sự tích lũy đường cũng có thể do nồng độ đường mannose dùng cho các lần thanh lọc chưa được chuẩn hóa đúng mức. Để khắc phục khó khăn này chúng tôi đã tiến hành tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc các mô sẹo còn sống. Từ các khối mô sẹo, những mô sẹo rời rạc, màu xanh hơi vàng được tách nhỏ và chuyển lên môi trường giống như ở lần thanh lọc 3 (Hình 4.6 và Hình 4.7). Sau hai tuần thì mẫu đối chứng chết hoàn toàn và mẫu lây nhiễm còn sống với tỉ lệ thấp là 10,4% đối với giống Coker 312 (Bảng 4.7) và 13,6% đối với giống VN36P (Bảng 4.8). Bảng 4.7. Tỉ lệ mẫu sống sót sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên môi trường thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu tách nhỏ Số mẫu sống sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 32 34 0 4 0 11,8 2 30 33 0 3 0 9,1 3 32 35 0 5 0 14,3 4 28 32 0 2 0 6,3 Trung bình 0 10,4 Bảng 4.8. Tỉ lệ mẫu sống sót sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên môi trường thanh lọc lần 3 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu tách nhỏ Số mẫu sống sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 37 36 0 5 0 13,9 2 33 33 0 5 0 15,2 3 35 32 0 4 0 12,5 4 36 31 0 4 0 12,9 Trung bình 0 13,6 32 Kết quả thu được cho thấy hiệu quả thanh lọc sẽ tốt hơn khi tách nhỏ mô sẹo, do đó sau khi thanh lọc lần 2 các khối mô sẹo nên được tách nhỏ rồi mới chuyển lên môi trường thanh lọc lần 3 để tránh hiện tượng thoát mẫu (escape) và việc thanh lọc sẽ hiệu quả hơn. Ngoài ra kết quả thu được cho thấy giống bông vải Coker312 và VN36P trong thử nghiệm này đáp ứng tốt với quá trình tạo mô sẹo. Mô sẹo ở các giống bắt đầu hình thành sau 14 ngày chuyển lên môi trường thanh lọc với tỉ lệ cao (97 – 98%). Trong khi đó một kết quả với tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp hơn (78% sau 10-15 ngày) đã được công bố (Chaudhary và ctv, 2003). Sự khác nhau giữa 2 kết quả này có thể là do Chaudhary và ctv đã sử dụng hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh kanamycin với nồng độ thanh lọc giảm dần, lần lượt là 50mg/l; 50mg/l; 25mg/l và 0mg/l. Ngoài ra giống bông vải được nghiên cứu trong báo cáo cũng khác nhau (Chaudhary và ctv đã nghiên cứu trên giống Coker 310). Trong khi đó ở mẫu đối chứng không chuyển gen thì tỷ lệ hình thành mô sẹo giống nhau (100%). Chúng tôi cho rằng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lây nhiễm là do hệ thống thanh lọc và giống được sử dụng khác nhau. 33 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả bước đầu thu nhận được về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P và việc ứng dụng hệ thống thanh lọc bằng đường mannose chúng tôi có những nhận xét sau: -Các giống bông vải Coker 312 và VN36P sau khi được chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (sử dụng vắc tơ pManCa mang gen pmi và gen gus), sau 3 vòng thanh lọc trên môi trường có chứa mannose cho tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót theo thứ tự đạt 10,4% và 13,6%, so với mẫu đối chứng (không chuyển nạp gen) có 0% tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót. Điều này cho thấy hệ thống chọn lọc mannose có hiệu quả trong thanh lọc chuyển nạp gen. Sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose có lợi điểm hơn so với các hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh vì làm giảm các mối lo ngại về tính an toàn sinh học của cây trồng biến đổi gen do việc sử dụng các gen đánh dấu chọn lọc là gen kháng chất kháng sinh. -Kỹ thuật tách nhỏ mô sẹo trong giai đoạn thanh lọc đóng vai trò rất quan trọng trong việc hạn chế sự phát triển của các mô không chuyển gen, đặc biệt đối với hệ thống thanh lọc bằng đường mannose. 5.2. Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vòng thanh lọc và thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều kiện cho hiện tượng thoát mẫu. Cần tiến hành song song nghiên cứu chuyển nạp gen cây bông vải sử dụng hệ thống thanh lọc bằng đường mannose bên cạnh các hệ thống thanh lọc phổ biến khác như hygromycin làm đối chứng nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen như vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, vật liệu nuôi cấy khởi đầu, quy trình chọn lọc, v.v. Trên cơ sở đó tiến hành hoàn thiện với hệ thống thanh lọc bằng đường mannose để ứng dụng trong việc nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của các giống bông đang được trồng ở Việt Nam. 34 CHƢƠNG 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình, 2001. Thực trạng chuyển nạp gen ở Việt Nam. Hội Nghị Nhận Thức Về Công Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 6-8 tháng 7 năm 2001. 2. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003. Mục tiêu và trương trình phát triển năm 2003 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 1/2003: 5-8. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử-Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (tập II: Chuyển nạp gen). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 4. Phạm Hoàng Hộ, 1997. Cây cỏ Việt Nam. Tái bản lần thứ ba. Nhà Xuất Bản Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. 5. Lê Kim Hỷ, 2003.Phát Triển Cây Bông Vải Ở Các Tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ. Hội nghị về phát triển cây bông vải ở Duyên Hải Nam Trung Bộ. 6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thuỷ Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường, 2002. Công nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 7. Lê Quang Quyến, 2004. Phát Triển Cây Bông Và Nghề Trồng Bông Ở Việt Nam. Viện Nghiên Cứu Cây bông và Cây có sợi. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 8. Binns A.N. and Costantino P, 1998. The Agrobacterium oncogens, p. 251-266. (Spaink.H.P, Kondorosi. A., Hooykaas. P. J. J. editors), In The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 9. Chauhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K and Pental D, 2003. Slow desication to high – frequency shoot recovery from transformed 35 somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutumL. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 10. Chaudhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K and Pental D, 2003. Slow desication to high – frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutumL. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 11. Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J. , Guo S.D., Jiao G.L. and Zhao J.X, 1994. The 2,4D Resistant transgenic cotton plants produce by Agrobacterium mediated gen transfer. Scientina Agiculture Sinica 27(2): 31 – 37. 12. Chen Z.X, Zhi X.J. and Xian S.J, 2000. High-efficiency Agrobacterium- mediated transformation of cotton using petiole explants. US Patent No.: WO 00/77230 A1. 13. Chilton M.D., Currier T.C., Farrand S.K., Bendich A.J., Gordon M.P and Nestor E.W, 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proceeding of National Academy Science. USA 71: 3672- 3676. 14. Chlan Y.L., Lin J., Cary J.W., and Cleveland T.E, 1995. A producer for biolistic transformation and regenration of transgenic cotton from meristematic tissues. Plant Molecular Bology Reporter. 13: 31-37. 15. Christou P, 1997. Rice transfomrmation: bombardment. Plant Molecular Biology. Reporter. 35: 179-203. 16. Cousin Y.L, Lyon B.R and Llewellyn D.J, 1991. Transformation of Australia cotton cultivars: Prospects for cotton improvement through genetic engineering. Australia Journal Plant Physiology., 18, 481-494. 17. Deacon J., Robertson A and Isbister A, 2005. The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. 18. Deng W., Chen L., Wood D.W., Metcalfe T., Liang X., Gordon M.P., Comai L and Nester E.W, 1998. Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host cyclophilins. Proceeding of the National Academy of Sciences 95: 7040-7045. 36 19. Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K and Murphy P.J, 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 20. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I.N., Raska K.A and Muray E.E, 1987. Transformation of cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeration of transgenic plants. Plant Molecular Bology 10: 105-116. 21. Gasser C.S. and Fraley K., 1992. Transgenic crops. Sci. Am. 266: 62-69. 22. Gelvin S.B., 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 23. Hoa T.T.C and Bong B.B, 2003. Effcient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa) using mannose selection system. Viet Nam Journal of Agriculture & Rural Development 1+2: 60-63. 24. Hoekema L. 1983. A binary vector strategy base on separation of Vir- and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180. 25. ISAAA, 2002. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2001 http://www.isaaa.org/kc/Publications/pdfs/isaaabriefs/Briefs 26b.pdf 26. James C. 2004. Preview: Global status of commercialized biotech/GM crops: 2004. International Service for the Acquisition of Agri – Biotech Applications (ISAAA), Excutive Summary. No. 32 – 2004: 4 – 8. 27. Jiang B.G, 2004. Optimization of Agrobacterium mediated cotton transformation using shoot apex explants and quantitative trait loci analysis of yeild and yeild component traits in Upland Cotton (Gossypium hirsutm L.). PhD. Thesis, Louisiana State University, USA. 28. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T., Ankenbauer R.G and Nester E.W, 1990. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology 172: 4945- 4950. 29. Korber H., Strizhov N., Staiger D., Feldwish J., Olsson O., Sandberg. G., Palme K., Schell J and Koncz C, 1991. T-DNA gen 5 of Agrobacterium modulates . NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả bước đầu thu nhận được về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P và vi c ứng dụng. lọc bằng đường mannose chúng tôi có những nhận xét sau: -Các giống bông vải Coker 312 và VN36P sau khi được chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (sử dụng vắc tơ pManCa mang gen. 42 148 42 146 100 98,6 2 39 146 39 143 100 97,9 3 42 147 42 143 100 97,3 4 40 143 40 142 100 99,3 Trung bình 100 98,3 Bảng 4. 3. Tỉ lệ mẫu sống sót và