100 Bảng 3.4: Qui trình phản ứng PCR Chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian 0 94 2 phút 1 đến 35 94 30 giây 51 hoặc 46 30 giây 72 2 phút 15 giây 36 72 5 phút 37 10 1 phút 38 4 15 phút 3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer Multiplex PCR rất cần thiết trong nghiên cứu về microsatellite vì nó có thể nghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác nhau cùng một lúc. Ngày nay với sự phát triển của các chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu cùng lúc những al có kích thước bằng nhau và được gắn các màu huỳnh quang khác nhau. Để phản ứng multiplex PCR cho kết quả tốt, tất cả các locus phản ánh đúng, chính xác thì các primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần nhau. Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay thành phần nước bằng thể tích của 2 cặp primer. Do đó tổng thể tích cho 1 phản ứng multiplex PCR là 22.2µl với thành phần phản ứng như sau: Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR Thành phần Dung dịch gốc Thể tích sử dụng PCR buffer MgCl 2 dNTP Primer mix 1 Primer mix 2 Primer mix 4 DNA mẫu 10X 25mM 1.5mM 1pmol/µl 1pmol/µl 1pmol/µl 50ng/µl 2.0µl 1.8µl 4.0µl 4.0µl 4.0µl 4.0µl 2.0µl 101 Taq polymerase 5U/µl 0.4µl Chúng tôi áp dụng qui trình PCR trên cho phản ứng multiplex PCR với 3 primer mTcCIR8, mTcCIR11 và mTcCIR15có cùng nhiệt độ T a = 46 o C. Ba primer này được đánh dấu bằng 3 màu huỳnh quang khác nhau: primer mTcCIR8 có màu xanh lá cây, mTcCIR11 có màu vàng và mTcCIR15 có màu đỏ. Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR Chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian 0 94 2 phút 1 đến 35 94 30 giây 46 30 giây 72 2 phút 15 giây 36 72 5 phút 37 10 1 phút 38 4 15 phút 3.2.6. Điện di sản phẩm PCR Đổ gel agarose với nồng độ 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong 2.5 phút, 500W . Trộn 2 µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad). Vận hành máy điện di ở 100V, 250A trong 15 phút. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút Các mẫu khác nhau nhưng được khuếch đại bởi cùng loại primer có băng điện di rất giống nhau nên không thể phân biệt được trên gel điện di agarose, cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự DNA. 3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA Sản phẩm PCR được đưa vào phân tích trình tự qua 3 bước chính:  Bước 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard và hidi formamide. Tổng thể tích cho 1 phản ứng trên máy giải trình tự DNA là 10µl với thành phần phản ứng như sau: Thành phần Thể tích dùng cho 1 phản ứng Sản phẩm PCR 0.5µl 102 Size standard Hidi formamide 0.5µl 9µl Bước 2: Biến tính mẫu ở 95 o C trong 5 phút bằng máy PCR để DNA mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. Sau đó phải giữ lạnh mẫu trong đá ngay để 2 mạch đơn không bắt cặp lại với nhau.  Bước 3: Bơm 10µl mẫu vào từng ô trên đĩa, sau đó đưa vào máy giải trình tự DNA đã được lắp đặt sẵn mao quản thích hợp và cài đặt chương trình phù hợp trong phần mềm Gene Mapper, là phần mềm sẽ phân tích kích thước al chứa trình tự microsatellite. Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên trong mao quản. Kết quả được phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công ty Master Food cung cấp. Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về kích thước và độ tin cậy của các al tương ứng với mỗi loại primer, 5 bin set của 5 loại primer sau khi được thiết lập trong phần mềm Gene Mapper sẽ phân tích kết quả tự động để cho ra dữ liệu của 2 al có độ tin cậy cao nhất của từng mẫu với mỗi loại primer. Do đó, có những trường hợp kết quả phân tích có nhiều hơn 2 al microsatellite nhưng bin set chỉ cho ra dữ liệu của 2 al đặc trưng nhất (có độ tin cậy cao nhất). Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu Hình 3.6: Lắp cappilary vào máy  Một số sản phẩm PCR được tinh sạch để so sánh hiệu quả phân tích giữa 2 nghiệm thức: tinh sạch và không tinh sạch. Qui trình tinh sạch gồm các bước sau: - Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM và 60µl Ethanol 100%. Đảo nhẹ ống và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút - Bước 2: Li tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4 o C. 103 - Bước 3: Hút bỏ dịch trong. - Bước 4: Hút 60µl Ethanol 70% cho vào mỗi ống. Li tâm 12000 vòng trong 20 phút ở 4 o C. - Bước 5: Hút bỏ dịch trong. Làm khô trong 30 phút. - Bước 6: Hoà tan DNA đã tinh sạch trong 10µl nước cất tinh khiết. Sau đó làm tiếp tục với ba bước phân tích trình tự như trên. 3.2.9.Phương pháp phân tính mức độ đồng nhất di truyền bằng phần mềm Cevus Cervus là một phần mềm phân tích tần số al để kiểm tra sự đồng nhất di truyền của các cá thể và tìm ra đời bố mẹ của cá thể dựa trên các chỉ tiêu được lựa chọn. Cervus phân tích tần số al dựa trên dữ liệu về kiểu gen của các codominant- loci. Dữ liệu đưa vào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được xuất ra dưới dạng file text. Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại và 13 mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8 để tiến hành phân tích sự đồng nhất của các cá thể dựa trên sự trùng khớp giữa các loci của chúng (matching loci), từ đó chúng tôi sẽ định danh được các mẫu mã hoá. Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả dựa trên dữ liệu microsatellite của 3 loci đã loại trừ những allele dropping (xem trang 57). Mỗi loci gồm 2 al đồng hợp (VD: al 292- al 292) hoặc 2 al dị hợp (VD: al 235- al 244), đây cũng chính là đặc tính của codominant-loci. Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus CODE 15A 15B 18A 18B 8A 8B BAL209 252 254 344 346 288 290 BAL244 244 246 337 344 292 292 BR25 235 244 331 344 302 305 KKM225 235 244 331 346 286 286 PBC123 235 244 331 342 288 290 PBC154 232 252 342 344 288 305 PBC157 235 250 331 346 288 302 ]PBC159 235 244 331 346 290 302 PBC230 235 250 331 342 286 288 PBC236 235 250 342 344 290 305 QH1213 252 254 344 346 288 290 QH22 232 252 342 344 288 302 QH441 232 254 342 344 288 288 104 A2 244 244 337 344 292 292 A3 235 250 331 342 288 290 A4 232 252 342 344 288 302 A5 235 244 331 346 286 286 A6 235 250 342 344 290 305 A7 252 254 344 346 288 290 A8 235 244 331 346 290 302 A9 235 244 331 344 302 305 A10 252 254 344 346 288 290 A11 235 250 331 346 288 302 A12 232 252 342 344 288 305 A13 235 250 331 342 286 288 A14 232 254 342 344 288 288 Chọn các chỉ tiêu phân tích để tìm ra các cá thể có sự đồng nhất di truyền bằng công cụ “Identity Check” trong phần mềm Cervus. Dựa trên các chỉ tiêu phân tích này, Cervus sẽ tiến hành kiểm tra tất cả các cá thể và đưa ra dữ liệu của những cặp cá thể có sự đồng nhất về mặt di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu đề ra. Có 3 chỉ tiêu chính sau:  Số lượng loci phân tích.  Số lượng loci đồng nhất tối thiểu  Số loci sai khác cho phép. Chúng tôi dựa trên kết quả kiểm tra và nhận diện các cặp cá thể có sự đồng nhất di truyền do Cevus phân tích để định danh các mẫu mã hóa. Do đó việc định danh sẽ chính xác và khách quan. 3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix Genetix là một phần mềm tiếng Pháp dùng cho nghiên cứu di truyền quần thể dựa trên định luật Hardy-Weinberg và xử lý bằng phép toán thống kê Fichier (Weir & Cockerham,1984) thông qua giá trị thống kê F. Giá trị này xác định mối quan hệ giữa các al của các cá thể và nó liên quan đến hệ số cận huyết. Hệ số này có thể đánh giá mối quan hệ không ngẫu nhiên giữa các al trong quần thể, nó cũng đánh giá sự giao phối thân cận giữa các đơn vị dưới quần thể và quần thể. Từ 21 dòng cacao khảo sát, căn cứ vào tên giống, chúng tôi có 6 quần thể với dữ liệu microsatellite tương ứng với 5 primer của mỗi cá thể được đưa vào phần mềm Genetix để tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể dựa trên biểu đồ 3D (3 chiều). 105 Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng cách di truyền giữa các quần thể. Hai quần thể càng tách biệt nhau về mặt di truyền thì tần số các al khác nhau càng rõ rệt. Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa các quần thể có sự giao phối ngẫu nhiên và có sự phân ly ít trong quá trình di truyền sẽ giúp chỉ ra cấu trúc của quần thể và dưới quần thể. Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix 106 Bi ểu đồ 3.1 : 6 quần thể với số lượng cá thể tương ứng Bi ểu đồ 3.2 : 5 primer với số lượng al tương ứng Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer 107 Phần 4 Kết quả và thảo luận  4.1.Sản phẩm DNA li trích Li trích DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Đối với lá cacao, việc li trích gặp một số khó khăn do lá cacao có lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh, bên trong mô lá chứa hàm lượng lớn polysaccharide, polyphenol và các sắc tố khác. (Hoàng Thị Liễu, 2004). Qui trình li trích DNA của chúng tôi đạt hiệu quả vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Vì ở qui trình li trích này, trong dịch trích DNA có chất mercapto có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bước ủ Rnase sẽ phân hủy RNA có trong mẫu li trích, góp phần hạn chế lượng DNA tạp tổng hợp từ RNA trong phản ứng PCR sau này. Đặc biệt sự có mặt của muối sodium acetate có khả năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA. Mặt khác, bước sử dụng Chloroform được lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu được rất tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra Kết quả định lượng DNA bằng quang phổ kế cho thấy DNA của các mẫu đem li trích có độ tinh sạch tương đối cao với tỉ lệ OD 260nm /OD 280nm nằm trong khoảng 1.5 đến 2.2 và lượng DNA có trong mỗi mẫu trung bình khoảng 50ng/µl. Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA 108  Những mẫu có tỉ lệ OD thấp, độ tinh sạch không cao, chúng tôi vẫn có thể chạy PCR đạt kết quả tốt bằng cách xử lý như sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, rồi li tâm ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4 o C để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trường hợp này thể tích DNA trong phản ứng PCR được tăng lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) và giảm thể tích nước đi 2µl. Bước pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bước li tâm tiếp theo sẽ giúp thu được DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. 4.2.Sản phẩm PCR Qui trình PCR cho kết quả ổn định với cả 5 cặp primer. Tuy nhiên primer mTcCIR11 thường cho những band rất mờ do mức độ khuếch đại thấp hơn các primer khác. Vì vậy khi pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi. Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7 Qui trình PCR cho kết quả tương đối ổn định. Những mẫu có nồng độ DNA li trích cao sẽ cho kết quả tốt khi chạy multiplex PCR, cho các band điện di sáng, rõ. Do đó khi thực hiện phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi. Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR 109 4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao Sản phẩm PCR có thể đưa vào phân tích ngay trên máy giải trình tự DNA mà không cần phải qua bước tinh sạch. Vì kết quả so sánh giữa 2 nghiệm thức tinh sạch và không tinh sạch cho kết quả phân tích như nhau. Do đó sản phẩm PCR không cần phải tinh sạch trước khi phân tích để giảm tốn kém. Ngoài ra để giảm thời gian (1 giờ cho mỗi 16 giếng trên đĩa) và hóa chất phân tích (size standard và hidi formamide), chúng tôi tiến hành trộn 3 sản phẩm PCR riêng biệt (0.5µl/1sản phẩm) với cùng một lượng size standard và hidi formamide như với 1 sản phẩm. Điều này giúp giảm chi phí xuống 3 lần mà vẫn cho kết quả phân tích tốt. Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất hiện band nào trên gel điện di hoặc band điện di quá mờ vẫn có thể cho kết quả khi phân tích trên máy giải trình tự DNA bằng cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đôi (1µl thay vì 0.5µl) trong hỗn hợp mang điện di. Trong trường hợp không nhận được kết quả khi phân tích microsatellite (No data), chúng tôi tiến hành hoàn thiện phản ứng bằng cách nâng lượng mẫu trong phản ứng PCR lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl). Do đó chúng tôi thu được kết quả phân tích của tất cả các mẫu với 5 primer. Kết quả phân tích 21 dòng cacao khảo sát với 5 cặp pimer được tóm tắt ở 2 bảng 4.1 và 4.2 với các cặp al đặc trưng sau khi đã loại trừ những allele dropping (xem trang 54). Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy 5 primer sử dụng có thể phân biệt được 21 kiểu gen khác nhau. Với đặc tính đồng trội (codominant), những cặp al khác nhau được gọi là dị hợp (VD: al 235- al 250), còn những cặp al giống nhau được gọi là đồng hợp (VD: al 288- al 288). Dựa vào 2 bảng dữ liệu dưới đây chúng tôi có thể định danh được 21 dòng cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được bảng dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và phân tích đa dạng di truyền. . được 21 dòng cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được bảng dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và phân tích đa dạng di. 5 7). Mỗi loci gồm 2 al đồng hợp (VD: al 292- al 29 2) hoặc 2 al dị hợp (VD: al 235- al 24 4), đây cũng chính l đặc tính của codominant-loci. Bảng 3. 7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích. gen của các codominant- loci. Dữ liệu đưa vào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được xuất ra dưới dạng file text. Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite