16 syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều loài thực vật khác nhau [9], [38]. Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật. Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97]. Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48]. Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại 17 tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro. 2.3.2. Sự tƣơng tác giữa Methylobacterium với thực vật. Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín. Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch. Holland và ctv (1994), cho rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại được vi khuẩn Methylobacterium. Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non. Ngoài ra, Methylobacterium còn sống ở rễ và hạt. Mật độ của PPFM trong khoảng 10 4 – 10 7 cfu (colony forming unit) trên mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng 10 5 cfu/gram [40], [59], [60]. Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ thích hợp với một số vi khuẩn). Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72]. Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo (cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B 12 (cyanocobalamine) và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata [39], [40], [51], [84]. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả 18 năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ, thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61]. 2.3.3. Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của PPFM lên thực vật. Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là: - Sự cô lập, chuyển hóa các khoáng dinh dưỡng (bao gồm khoáng vi hay đa lượng) từ môi trường hoặc từ đất cho cây. Cơ chế cô lập các khoáng dinh dưỡng liên quan đến sự tổng hợp các phân tử có lợi cho quá trình hấp thu những ion. Cơ chế này đã được chỉ ra ở vi khuẩn rễ ở một số thực vật [46], [61], [93]. - Sự tổng hợp các phytohormone hay các hợp chất tương tự phyohormone được phóng thích vào môi trường hay vào hệ thống mạch của thực vật. Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp cytokinin, auxin và hợp chất tương tự auxin bởi một vài chủng PPFM [24], [39], [40], [55], [71], [72]. - Sự tổng hợp và giải phóng các enzyme tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh hóa hay sinh lý của mô thực vật. Sự tổng hợp enzyme urease bởi vi sinh vật đã được chỉ ra ở nhiều chủng PPFM. Urease rất cần thiết trong quá trình biến dưỡng nitrogen ở thực vật [40], [61]. - Cơ chế thứ tư góp phần gia tăng sự tăng trưởng của cây lúa nói riêng và các cây trồng khác nói chung có thể là do sự tổng hợp và phóng thích vitamine B 12 hoặc những hợp chất tương tự. Nghiên cứu của Basile và ctv (1985), đã chứng minh rằng việc bổ sung vitamine B 12 nồng độ thấp có thể gia tăng sự tăng trưởng của hai loài địa tiền - liverwort in vitro [61], [84]. 19 Khả năng tổng hợp các phytohormone không chỉ hiện diện ở thực vật mà còn diễn ra ở cả vi sinh vật. Khả năng tổng hợp các phytohormone đã được xác định ở nhiều vi sinh vật. Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng nitrogen. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone. Chủng Rhizobium có thể tổng hợp gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp. có thể tổng hợp GA, auxin và cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA. Nên chúng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như in vitro [24], [71]. Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân. Sự tạo indole và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi khuẩn gram âm hiếu khí. Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24], [26], [71]. Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation) của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT), được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như 20 cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao. Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được Koenig và ctv (2001), kiểm tra. Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được. Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và 19,6ng/mg. Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57], [58]. Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây (Fragaria ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp tiền chất của 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2,5-dimethyl-4- methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở mesifuran, không gram ở mẫu đối chứng. Sự gia tăng hàm lượng của DMHF và mesifuran là do vi khuẩn PPFM có khả năng oxy hóa 1,2-propanediol thành lactaldehyde. Vì lactaldehyde được tạo ra từ vi khuẩn được sử dụng bởi những tế bào dâu tây trong quá trình sinh tổng hợp hai furanones trên [100]. 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng của thực vật Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB (Poly- -Hydroxybutyrate). Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng của nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật. Vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng lượng khô. Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình Calvin-Benson- Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô. Và ở vi khuẩn sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện 21 giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65]. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất 25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO 2 . Trong khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4- Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89]. Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên cây dương Poplar (P. deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88]. Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn 22 nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, - carotene, vitamine B 12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90]. Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài Methylobacterium sp. mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt. Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101]. 2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống. Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái. Phương pháp này được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987. Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật. - Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động, … - Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp,… Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97]. 23 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium [41] Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Methylamine + + + + + + + – – + – + + + - Trimethylanine – – – + – – – – – + – – – – + Acetate + + + + + + + + – + + + + + + Citrate – – – – – – + + + – + + + + + + + + – + + Glutamate – – + + – – + + + + + + + + + + + + – + + Glucose + – – – – – + + + – + + – – – + + – – – + Arabinose – – – – – – + + + – + + – – – – – – – + + Fructose + + – + + + + – – + – + – + + + + – + – + Betaine + – + – + – + + – + – nd + + + Tartrate v – – V – – – v Serbacate – – – – – + v + + Ethanol + + + + + V + v + nutrient agar v + + + + + – + + Methane – v – – – – – – chú thích: 1: M.suomiense; 2: M. lusitanum; 3: M. extorquens; 4: M. organophilum; 5: M. rhodesianum; 6: M. zatmanii; 7: M. rhodinum; 8: M. radiotolerans; 9: M. mesophilicum; 10: M. aminovorans; 11: M. fujisawaense; 12:M. thiosyanatum; 13: M. chloromethanicum; 14: M. dichloromethanicum;15: M. hispanium; 16: M. aquaticum; 17: M. variable; 18: M. isbiliense; 19: M. populi;20: M. nodulans. 21 :1019. +:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi. 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di truyền) 2.4.2.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử. Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử (vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein, Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại. + Sử dụng mẫu dò (probes) Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là 24 một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang. + Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [4], [67], [95]. Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA. Nguyên tắc của phương pháp PCR Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng. + Giải trình tự (sequencing) [5]. Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert (1977), Sanger và ctv (1977), công bố. Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng: - Phương pháp Maxam và Gilbert Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau. - Phương pháp Sanger Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ một dây nền của DNA - Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp) Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu. 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật. Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S). Chúng đảm nhận chức năng 25 duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại rRNA thì rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt. Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh. Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự rDNA 16S để định danh cần chú ý: - Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu) - Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn 0,5%. Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra, trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA 16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu [29], [30], [31], [68]. [...]... thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[ 34] Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS ): - K2HPO4 1,2g - KH2PO4 0,62g - CaCl2.6H2O 0,05g - MgSO4.7H2O 0,2g - NaCl 0,1g - FeCl3.6H2O 1mg - (NH4)2SO4 0,5 g - CuSO4.5H2O 5 g - MnSO4.5H2O 10 g - Na2MoO4.2H2O 10 g 27 - H3BO3 10 g - ZnSO4.7H2O 70 g - CoCl2.6H2O 5 g - Nước cất - pH vừa đủ 1000ml 7 Môi trường MMS được thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 121 0C... Nước BN20 2 TB Nước BN21 3 TB Lá BS16 4 TB Lá BS17 5 TB Lá BS18 6 TB Đất BD11 7 TB Leaf print LB5 8 Truông mít (TM) Nước TN10 9 TM Nước TN 12 10 TM Nước TN13 11 TM Lá TS6 12 TM Lá TS7 13 TM Lá TS8 14 TM Lá TS9 15 TM Leaf print (LP) LM1 42 16 TM LP LM2 17 TM LP LM3 18 TM LP LM4 19 TM Đất TD15 20 Gò dầu (GD) Nước GN19 21 GD Nước GN25 22 GD Lá GS 22 23 GD Lá GS23 24 GD Lá GS24 25 GD Đất GD14 26 GD Đất GD26... excel + Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20 , 25 , 30, 35, và 400C và đo OD ở bước sóng 610nm sau ba ngày + Khảo sát ảnh hưởng của... nghiệm IDS14GR + Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn Phương pháp th : - Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vi sinh vật trên lam - Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên dòng thuần vi sinh vật cấy dày đặt trên mặt thạch nghiêng Kết qu : Thử nghiệm dương tính khi có bóng khí xuất... vừa đủ 25 l 3.3.3 .2 Các primer sử dụng [9], [68] FPGS150 9: 5` AAGGAGGGGATCCAGCCGCA 3` FPGS 6: 5` GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG 3` 2F: 5` GATCGGCCCGCGTCTGATTAG 3` 2R: 5` CCGTCATTATCGTCCCGGACA 3` Hình 3. 1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA Để định danh các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp đã phân lập được chúng tôi tiến hành các phản ứng như sau: - Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium. .. trong thạch mềm Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn không di động nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động Môi trường thử nghiệm là môi trường thạch mềm LDC (trong IDS14GR) 3 .2. 6.4 Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon để tăng trưởng, đồng thời tiết... nhiên trên ruộng lúa ở ba xã khác nhau:xã Truông Mít (huyện Dương Minh Châu), xã Gia Lộc (huyện Trảng Bàng), xã Bàu Đồn (huyện Gò Dầu) tỉnh Tây Ninh bao gồm các mẫu lá, nước, đất Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ 3 .2. 2 Tăng sinh vi khuẩn Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp l : Leaf print trực tiếp trên đĩa môi trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc 29 Sau khoảng 2 – 3 ngày lấy... lân cận 0,1, 0 ,2; 0,4; 0,5 35 Từ các độ đục tiến hành pha loãng đến 10-5; 10-6; 10-7 Từ mỗi độ pha loãng cấy 0,1ml vào mỗi đĩa môi trường rắn CP Ủ 300C trong 48 giờ đếm khuẩn lạc ở các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300 Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: Ndi = A x 10 x di Trong đ : - Ndi: số lượng tế bào ở độ pha loãng di - A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa - d: số lần pha loãng... PCR với cặp mồi 2R và 2F với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 23 4bp Với chu trình nhiệt như sau: 38 Hình 3. 2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R - Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung cặp mồi 2R và 2F Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và 120 0base Với chu... hoạt chất do vi khuẩn tiết ra Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 25 0C trong môi trường CMS và tiến hành đo OD610nm 4 giờ/lần trong vòng 48 giờ 3.3 Định danh vi khuẩn Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau: 3.3.1 Tính hệ số tƣơng đồng di truyền Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau của hai loài vi khuẩn Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của . fujisawaense; 1 2: M. thiosyanatum; 1 3: M. chloromethanicum; 1 4: M. dichloromethanicum;1 5: M. hispanium; 1 6: M. aquaticum; 1 7: M. variable; 1 8: M. isbiliense; 1 9: M. populi ;2 0: M. nodulans. 21 :1 019. +:có. 0,62g - CaCl 2 .6H 2 O 0,05g - MgSO 4 .7H 2 O 0,2g - NaCl 0,1g - FeCl 3 .6H 2 O 1mg - (NH 4 ) 2 SO 4 0,5 g - CuSO 4 .5H 2 O 5 g - MnSO 4 .5H 2 O 10 g - Na 2 MoO 4 .2H 2 O 10 g 27 . chất của 2, 5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2, 5-dimethyl-4- methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với vi khuẩn PPFM thì hàm l ợng DMHF l 5g/860,5g