35 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc phản ứng PCR, sau kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, sau phản ứng PCR xảy thu đƣợc sản phẩm đoạn DNA đầu dính Do điều kiện thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu plasmid đoạn DNA từ sản phẩm PCR, tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow) Phản ứng tạo đầu Đầu Đầu dính Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu (blunt-end) cho đoạn DNA Thiết lập phản ứng phủ đầu với thành phần nhƣ sau: NEbuffer 10X 2µl DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl DNA fragment Klenow unit (1µl) Thêm nƣớc 20µl Ủ phản ứng 250C 15 phút, sau ngừng phản ứng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol ủ 750C 20phút Thiết lập phản ứng phủ đầu cho plasmid Plasmid sau cắt HindIII, thực phản ứng phủ đầu theo qui trình sau: NEbuffer 10X 2µl DNA plasmid 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl 36 DNA fragment Klenow unit (1µl) Thêm nƣớc 20µl Ủ phản ứng 250C 15 phút, sau ngừng phản ứng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol ủ 750C 20phút 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối plasmid đoạn DNA đầu (phản ứng nối blunt-end) T4 DNA ligase không giống nhƣ E coli DNA ligase, xúc tác phản ứng nối đoạn DNA đầu (Sgaramella Khorana 1972, Sgaramella Ehrlych 1978) Tuy nhiên phản ứng gắn kết khơng có đƣợc hiệu suất cao cần phải có yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti Sgaramella 1981), nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert vector cao, tỉ lệ số mol vector đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10 Trong phản ứng nối blunt-end thêm vào chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride Các chất có vai trị làm tăng tốc độ phản ứng ligation từ 1-3 lần, điều cho phép lƣợng DNA nồng độ ligase giảm xuống không ngừng xếp sản phẩm nối, nối bên ngồi phân tử đƣợc ngăn chặn, có phản ứng nối vector-DNA insert phản ứng nối vector-vector xảy Từ lượng vector DNA tính lượng DNA chèn (ng)DNA chèn = Vector (ng) x DNA chèn (kb) X Vector (kb) Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector Căn vào tỉ lệ số mol vector DNA chèn dựa vào để tính lƣợng DNA cần sử dụng Thực phản ứng nối với thành phần nhƣ sau: T4 reaction buffer 1µl DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng) DNA plasmid 1µl (50ng) T4 ligase unit Thêm nƣớc 10µl Ủ phản ứng 160C qua đêm, tinh trực tiếp sản phẩm cách sử dụng cột tinh GFX thu lại 3μl elution buffer 37 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α khả nạp (theo quy trình Sambrook cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) Thực biến nạp theo quy trình sau: - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh đá 20 phút - Chuyển nhanh eppendorf vào bồn nhiệt 420C, giữ 90 giây - Chuyển nhanh eppendorf vào bình nƣớc đá, giữ phút - Thêm 200µl mơi trƣờng LB lỏng vào eppendorf ủ 370C - Hút 200µl dịch vi khuẩn biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang bề mặt môi trƣờng - Để đĩa nhiệt độ phòng khô bề mặt - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm 370 C (khoảng 14 - 16 giờ) - Quan sát khuẩn lạc đĩa petri, bắt khuẩn lạc trắng cấy sang mơi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) 16-18 Thực biến nạp theo quy trình plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng Bắt khuẩn lạc xanh cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) 16-18 Thực tách chiết plasmid theo qui trình mục 3.4.6.1 38 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn B A C Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn thể tích 10:1.5 (A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp plasmid theo thể tích (µl) 10:1.5 phục hồi 500µl mơi trường LB lỏng 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp có tế bào khả nạp khơng có plasmid (thể tích 10µl tế bào khả nạp) phục hồi 500µl mơi trường LB lỏng 1h, cấy 100 µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm 370C 39 A B C D Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn thể tích 3:0.5 (A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp plasmid theo thể tích (µl) 3:0.5 phục hồi 200µl mơi trường LB lỏng 1giờ, cy 10 àl (nng pha loóng ẵ) dch phc hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp có tế bào khả nạp khơng có plasmid (thể tích 10µl tế bào khả nạp) phục hồi 200µl mơi trường LB lỏng 1h, cấy 100µl (nồng độ pha lỗng ½) dịch phục hồi lên đĩa mơi trường LB agar/Xgal/IPTG, ủ qua đêm 370C; (D) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp plasmid theo thể tích (µl) 3:0.5 phục hồi 200 µl mơi trường LB lỏng 1h, cấy 100µl (nồng độ pha lỗng ½) dịch phục hồi lên đĩa mơi trường LB agar/Xgal/IPTG, ủ qua đêm 370C 40 Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình (ở thể tích biến nạp 3:0.5, dịch biến nạp pha lỗng ½ trang lên đĩa) cho kết tốt chọn lọc thể biến nạp theo quy trình (ở thể tích biến nạp 3:0.5, dịch biến nạp khơng pha lỗng trang lên đĩa) chọn lọc thể biến nạp theo quy trình (ở thể tích biến nạp 10:1.5) Biến nạp theo quy trình cho kết vài khuẩn lạc xanh xuất có nhiều khuẩn lạc màu trắng mơi trƣờng Điều giải thích q trình làm thí nghiệm có số tế bào tự thân có khả kháng lại với kháng sinh thao tác trang X-gal không xung quanh đĩa nên tế bào tiếp nhận plasmid nhƣng khơng có X-gal để phân hủy cho khuẩn lạc trắng tế bào tiếp nhận plasmid nhƣng trình phục hồi biểu gen LacZ diễn chậm (đối với khuẩn lạc quan sát kỹ thấy màu xanh nhạt) Kết biến nạp theo quy trình cho nhiều khuẩn lạc xanh khuẩn lạc trắng nhiều so với biến nạp theo quy trình Nhƣ cho thấy quy trình hiệu biến nạp tốt thể tích biến nạp nhƣ hợp lí Khuẩn lạc mọc rời rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh khối để li trích đƣợc plasmid Kết biến nạp theo quy trình cho nhiều khuẩn lạc xanh cho nhiều khuẩn lạc trắng so với biến nạp theo quy trình Khuẩn lạc xanh nhiều nhƣng mọc dày khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh môi trƣờng lỏng Nhƣ vậy, qua kết chọn lọc thể biến nạp môi trƣờng LB agar/Amp/Xgal/IPTG chúng tơi thấy biến nạp theo quy trình thích hợp 4.2 Tách chiết DNA plasmid 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid Bắt khuẩn lạc xanh môi trƣờng đĩa tiến hành cấy sang ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh 60µg/ml ni cấy lắc 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết nhƣ sau: 41 DNA plasmid 3.0kb DNA genome Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 1% (lần 1) Kết tách chiết plasmid lần cịn lẫn nhiều DNA genome vi khuẩn Có thể điều thêm dung dịch III vào để lâu nên DNA plasmid DNA gen hồn tính DNA plasmid 3.0kb Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 1% (lần 2) Với nhận định tiến hành tách chiết plasmid lần để khẳng định lại quy trình Nhờ khắc phục sai sót lần kết lần tách chiết cho thấy loại đƣợc DNA genome, thu đƣợc plasmid Nhƣ vậy, quy trình tách chiết plasmid chuẩn, sai sót xảy khắc phục Kết tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản Sản phẩm tách chiết dùng để thực phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, sở để kiểm tra kết biến nạp 42 Những điểm cần lƣu ý chiết tách plasmid Khi thêm dung dịch II đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau phải thêm dung dịch III để trung hòa dung dịch II Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm không DNA gen phục hồi cấu trúc sản phẩm plasmid chiết tách có lẫn DNA gen Ở bƣớc quy trình tách chiết, sau ly tâm xong phải lấy nhẹ nhàng cẩn thận hút phần dịch bên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid AurumTM Plasmid Mini Kit Tách chiết plasmid Kit cho hiệu tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu đƣợc nhiều hơn, tinh hơn, thao tác đơn giản, nhanh Sản phẩm tách chiết không cần phải qua bƣớc tinh để sử dụng cho bƣớc trình cloning Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid Kit DNA plasmid 3.0kb gel agarose 1% 4.3 Phản ứng cắt plasmid enzyme cắt giới hạn EcoRV DC1 EcoRV DC2EcoRV Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid EcoRV gel 1% (lần 1) (DC1) sản phẩm li trích plasmid kit; (EcoRV 1) sản phẩm cắt đươc enzyme EcoRV; (DC2) sản phẩm li trích plasmid kit; (EcoRV 2) sản phẩm không cắt EcoRV 43 Kết hình cho thấy plasmid cắt hồn tồn kích thƣớc, vector đƣợc mở vịng vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng có sản phẩm tách chiết plasmid mẫu đối chứng đƣợc cắt Do chúng tơi tiến hành phản ứng cắt lần để kiểm tra hoạt tính cắt enzyme EcoRV thu đƣợc kết nhƣ sau: DC Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm cắt gel agarose 1% (lần 2) (DC): sản phẩm cắt EcoRV lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt RsaI Mẫu (1) (2) sản phẩm tách chiết plasmid không bị cắt enzyme EcoRV mẫu (3), (4) đƣợc cắt hồn tồn Vì tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản phẩm tách chiết có phải plasmid mong muốn hay khơng thu đƣợc kết nhƣ sau: DC DC DC DC Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm cắt cắt HindIII gel agarose 1% HindIII gel agarose 1% (1), (2), (3): sản phẩm cắt (1), (2): sản phẩm cắt HindIII; HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết (DC): sản phẩm tách chiết plasmid plasmid 44 Plasmid cắt hồn tồn nhƣ kích thƣớc plasmid đối chứng Do suy rằng, q trình làm thí nghiệm plasmid bị hƣ site cắt EcoRV vùng MCS enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên khơng thể nhận biết đƣợc vị trí site cắt EcoRV vùng MCS Vì để tiến hành thí nghiệm chúng tơi định chọn sản phẩm cắt HindIII, phủ đầu để thực phản ứng nối Một số điều cần ý thực phản ứng cắt RE giữ đƣợc hoạt tính dung dịch đệm chứa 50% glycerol luôn đƣợc bảo quản -200C Khi tiến hành phản ứng thủy giải, lấy RE vào phút chót sau đủ thành phần khác giữ đá thời gian ngắn tốt trƣớc cất trở lại vào -200C Nên tiến hành phản ứng thể tích nhỏ tốt để tạo thuận lợi cho tiếp xúc enzyme-cơ chất Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt q 1/10 thể tích phản ứng glycerol ức chế hoạt động enzyme 4.4 Tinh đoạn DNA plasmid sau cắt HindIII 4.4.1 Tinh đoạn DNA Trong đề tài này, thực chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid tiến hành phản ứng tạo đầu cho đoạn DNA sau tinh đoạn DNA Kết điện di cho thấy trình tinh loại hết thành phần tạp sản phẩm PCR Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR nên sử dụng sản phẩm PCR muốn tinh khơng có band phụ, sản phẩm PCR có band phụ phải tinh từ gel Phản ứng tạo đầu cho đoạn DNA enzyme Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc phƣơng pháp điện di gel agarose, kết kiểm tra chèn vào đƣợc plasmid biến nạp vào vi khuẩn 45 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm tinh đoạn DNA phƣơng pháp tinh đoạn DNA phƣơng pháp cắt gel thu hồi lại cột GFX cắt gel thu hồi lại cột GFX (1), (2): sản phẩm PCR kích thước (1): sản phẩm PCR kích thước 223bp; 900bp; (3): ladder 100bp (2), (3): sản phẩm PCR kích thước 900bp Một số điều cần lƣu ý thực tinh đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ cột, giọt một, rửa thêm capture buffer nhỏ thành cột, cân eppendorf trƣớc để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn sau cân, sau trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar) Chuẩn bị trƣớc tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau lần chạy điện di thay buffer Sử dụng ethidium bromide lỗng ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay nhuộm mẩu, tính tốn số mẩu trƣớc chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu giữ buffer 4.4.2 Tinh plasmid Plasmid sau dùng enzyme HindIII cắt mở vòng tinh Kết điện di cho thấy sản phẩm sau tinh loại hết tạp sản phẩm 46 DC TS Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm tinh gel agarose1% (DC) plasmid cắt HindIII chưa tinh sạch; (TS) plasmid cắt HindIII tinh cột GFX Từ sản phẩm tiến hành phản ứng phủ đầu cho plasmid tinh lại qui trình tinh sử dụng RNAse Sau tiến hành pha lỗng chuẩn bị cho phản ứng nối 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực phản ứng phủ đầu cho sản phẩm PCR plasmid sau cắt HindIII, tinh sản phẩm, nối đoạn sản phẩm PCR vào plasmid Biến nạp plasmid nối vào vi khuẩn E coli DH5α khả nạp,và thực tƣơng tự với plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng thu đƣợc kết nhƣ sau: Cả hai trƣờng hợp biến nạp đọan DNA 900bp 223bp cho toàn khuẩn lạc màu trắng môi trƣờng LB agar/Amp/X-gal/IPTG A B Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp (A) Biến nạp plasmid chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp C 47 Kết biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn khuẩn lạc màu trắng tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng kháng sinh tạo thành Còn đĩa đối chứng xuất khuẩn lạc màu xanh trắng 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trƣờng LB lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình mục 3.4.6.1 Chạy điện di thu đƣợc tồn genome vi khuẩn Cịn kết li trích plasmid khuẩn lạc xanh đĩa đối chứng thu đƣợc DNA plasmid Nhƣ biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α chƣa thành cơng Điều nồng độ plasmid sau cắt nối sử dụng để biến nạp chƣa phù hợp, chúng tơi khơng thể tính tốn đƣợc nồng độ plasmid hao hụt sau thực phản ứng cắt nối Hoặc thời gian sốc nhiệt ngắn nên plasmid biến nạp vào tế bào vi khuẩn Do đó, q trình phủ đầu cho đoạn DNA plasmid phải ý cẩn thận tính tốn thành phần phản ứng cho phù hợp Cịn q trình thiết lập phản ứng nối phải ý đến việc tính tốn tỉ lệ thể tích vector đoạn DNA, nhiệt độ ủ phản ứng cho phù hợp nên thêm chất xúc tác cho phản ứng nối nhƣ: PEG hay Hexamminecobalt chloride Biến nạp vào vi khuẩn nên sốc nhiệt thời gian lâu hơn, thử nghiệm nhiều qui trình khác thời gian sốc nhiệt kèm theo đối chứng Vì thời gian giới hạn chúng tơi khơng thử nghiệm nhiều quy trình khác nên không cho đƣợc kết nhƣ mong muốn 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua q trình tiến hành thí nghiệm chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ sau: - Hoàn thiện quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp phƣơng pháp hóa học, tế bào khả nạp tế bào khả nạp giữ -70oC với glycerol thời gian tháng - Hồn thiện đƣợc quy trình biến nạp plasmid pBluescript SK(+/-) vào vi khuẩn E coli DH5α chọn lọc thể biến nạp môi trƣờng chứa Ampicillin/X-gal/IPTG - Đã đƣa quy trình tách chiết plasmid chuẩn phƣơng pháp SDS – kiềm (theo quy trình Sambrook cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang mơi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh Chọn ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ ống cho vào eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối 10000 vòng/phút phút 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, phút 200C, lặp lại hết dịch nuôi cấy ống nghiệm Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào eppendorf chứa sinh khối, vortex đến sinh khối vi khuẩn tan hết Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút 200C Thu hết dịch cho vào eppendorf tƣơng ứng Bƣớc 6: Cho vào eppendorf chứa dịch vừa thu đƣợc 1µl RNAse, ủ 370C trong1 Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút phút 200C Thu dịch cho vào eppendorf tƣơng ứng 49 Bƣớc 8: Cho vào eppendorf 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút phút 200C Thu dịch cho vào eppendorf tƣơng ứng Bƣớc 9: Thêm vào eppendorf 300µl isopropanol, ủ -200C giờ, ly tâm 13000 vòng/phút 20 phút 200C Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa Bƣớc 10: Rửa tủa cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút 40C Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa làm khô cách úp ngƣợc giấy thấm Bƣớc 11: Cho TE vào eppendorf để hòa tan kết tủa Tùy lƣợng mẫu mà thêm vào Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di agarose nồng độ 1% 30 phút để xem kết chiết tách - Đã thiết lập đƣợc phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn để kiểm tra kết tách chiết 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình cắt HindIII, nối đoạn DNA từ phản ứng PCR vào plasmid pBluescript SK(+/-) biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α - Thực phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm nối plasmid pBluescript SK(+/-) cắt HindIII đoạn DNA từ phản ứng PCR, giải trình tự sản phẩm nối 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục Lê Đình Lƣợng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh Cao Cƣờng, 2002, Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP HCM Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005, Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp ứng dụng, NXB Nông Nghiệp TP HCM Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005, Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α, Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại Học Nông Lâm TP HCM Phạm Thành Hổ, 8-2003, Di truyền học, NXB Giáo Dục Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999, Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại Học Quốc Gia TP HCM – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại Học Quốc Gia TP HCM 29 trang Tài liệu tiếng nƣớc T.A Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall 10 Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan 11 Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH 12 Sambrook J, E F Fritsch and T Maniatis, 1989, Molecular cloning laboratory manual, second edition, CSH 13 Wolgang Schumann, 1995, Genetic Engineering Techniques Các website http://www.protocol-online.org/prot/Mmolecular_Biology/ http://brahms.chem.uic.edu/~cgpage/protocol/cloning.html A 51 http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd http://bioprotocol.endlex.com/protocols/lygation.html 52 PHỤ LỤC Công thức pha số mơi trƣờng dùng thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc 1000 ml Hấp khử trùng 1210c 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc 1000 ml Hấp khử trùng 1210c 20 phút  Môi trƣờng LB + Ampicillin Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc 1000 ml Hấp khử trùng 1210c 20 phút, sau để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 100µg/ml  Mơi trƣờng LB + Ampicillin + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coli) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillin, dùng que trang, trang đĩa, mặt thạch khô Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đĩa khô mặt thạch 53 Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0 Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch độc, phải cẩn thận thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan ml nƣớc khử ion, sau lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,2μm 54 Dung dịch kháng sinh Ampicillin 100mg/ml Cân 100mg ampicillin dạng bột, hoà tan 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,45μm Các loại buffer  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM  Ligation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM 55 Hình Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 56 Hình Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) ... trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn B A C Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn thể tích 1 0:1 .5 (A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp plasmid theo thể tích (µl) 1 0:1 .5 phục hồi 500µl... đêm 37 0C 40 Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình (ở thể tích biến nạp 3: 0 .5, dịch biến nạp pha lỗng ½ trang lên đĩa) cho kết tốt chọn lọc thể biến nạp theo quy trình (ở thể tích biến nạp 3: 0 .5,... agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm 37 0C 39 A B C D Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn thể tích 3: 0 .5 (A )Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp plasmid theo thể tích (µl) 3: 0 .5 phục hồi 200µl mơi