BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐẶNG TRẦN ANH THƢ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐẶNG TRẦN ANH THƢ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  POPULATION STRUCTURE OF Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student LE DINH DON DANG TRAN ANH THU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM TẠ  TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu trong thời gian làm đề tài. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập. CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này. TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006 Đặng Trần Anh Thư ii TÓM TẮT KHÓA LUẬN  ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”. Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho phù hợp.  Phƣơng pháp nghiên cứu: - Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn - Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển và cố định DNA lên màng - Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu và phát hiện bằng huỳnh quang - Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền.  Kết quả: - DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn - Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M. grisea - Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối chứng là plasmid pMGY-SB.  Kết luận : Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công. Do đó, không có cơ sở để phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M. grisea. iii MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt vi Danh sách các hình vii Danh sách các bảng viii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Sơ lược về cây lúa 3 2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) 3 2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa 3 2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa 4 2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh 5 2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh 5 2.3. Phương pháp Southern blot 6 2.4. Enzyme cắt giới hạn 7 2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng 8 2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên 8 2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống 9 2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều 9 2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện 9 2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không 9 2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea 10 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea 12 iv 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 14 3.2. Đối Tượng khảo sát 15 3.3. Nội dung thực hiện 15 3.4. Vật liệu và hóa chất 16 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 16 3.4.2. Hóa chất 16 3.5. Phương pháp nghiên cứu 17 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M. grisea (isolate) 17 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm 17 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phương pháp lysis 18 3.5.1.3. Phương pháp tinh sạch DNA 18 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 18 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp 18 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) 19 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp 19 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit 21 3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid 22 3.5.4. Tạo mẫu lai 22 3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn 23 3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 23 3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phương pháp mao dẫn hướng lên 24 3.5.4.4. Làm khô màng 25 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng 25 3.5.5. Lai southern 26 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai 26 3.5.5.2. Rửa màng sau khi lai 26 v 3.5.5.3. Phát hiện kết quả trên phim X-ray 27 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. 28 4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α 30 4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn 31 4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB 33 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1. Kết luận 38 5.2. Đề nghị 38 TÀI NIỆU THAM KHẢO 49 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair B: Bam HI Ctv cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol DIG: Digoxigenin E: Eco RV ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid H: Hind III HRP: Horseradish peroxydase Kb: kilobase PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid RT: Reverse transcrip SDS: Sodium dodecyl sulfate SSC: Saline sodium citrate TAE: Tris Acetate EDTA TBE: Tris-base Boric EDTA UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) 4 Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi 5 Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea 6 Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY 10 Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea 28 Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse 30 Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 31 Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn .32 Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai 34 Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film 35 [...]... của nấm Magnaporthe grisea Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít Xuất phát từ tình hình trên, tôi đã thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa , nhằm phân tích được cấu trúc di truyền giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long 5.4 Mục... do nấm, vi khuẩn và số ít là do virus Bệnh do nấm gây ra điển hình nh : bệnh đạo ôn, đốm nâu, bệnh khô vằn và một số bệnh khác Bệnh do vi khuẩn gây ra nh : cháy bìa lá lúa, bệnh vàng lá lúa Bệnh do virus gây ra như lùn soắn lá lúa Trong đó, bệnh do nấm gây ra là thường gặp nhất và gây tổn thất nhiều nhất [6] 2.2 Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) 2.2 .1 Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa Bệnh. .. năng suất lúa gạo do bệnh này gây ra giảm 30% trên toàn thế giới Ở Việt Nam, đạo ôn cổ gié đã gây hại 13 8.000 ha trong năm 19 91 và 217 .000 ha trong năm 19 92 ở đồng bằng Sông Hồng Bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng ở đồng bằng Sông Cửu Long từ 19 78 -19 81 [11 ] Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tổng di n tích bị nhiễm bệnh đạo ôn trong vụ Đông Xuân 2003-2004 là... trổ thì gọi là bệnh cháy lá Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa a) b) Hình 2 .1 Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) Nguồn: http//:aesrg.tamu.edu/Ricerice.htm Trên m : vết bệnh có hình thoi nhỏ, màu hồng hoặc nâu vàng Bệnh nặng, từng đám vết bệnh liên kết... cầu 5.4 .1 Mục đích Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn bằng phương pháp Southern blot 5.4.2 Yêu cầu - Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea - Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid - Thiết lập được phản ứng lai... Trị (Cần Thơ) là những nơi thường có bệnh [6] 2.2.2 Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là bệnh đạo ôn Khi dịch cháy lá xảy ra trên di n rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo... so với Đông Xuân 2003), vụ Hè Thu 2006 là 38.346 ha lúa bị nhiễm đạo ôn lá và 4046 ha bị nhiễm đạo ôn cổ bông Trong những năm gần đây, người trồng lúa đã áp dụng nhiều biện pháp phòng trừ nh : phun thuốc di t nấm và tăng cường trồng giống kháng trên di n rộng Thuốc di t nấm có thể giảm một phần thiệt hại của bệnh nhưng không tiêu di t được bệnh Những giống kháng có thể kháng được bệnh đạo ôn nhưng... mô tả đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 16 37 Năm 17 04, M Tsuchiya (Nhật) bắt đầu nghiên cứu hiện tượng cháy lá trên cây lúa Sau đó, bệnh được báo cáo có ở nhiều quốc gia khác như là Ý (17 88), Mỹ (18 76) và Ấn Độ (19 13) Đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới [2] Ở Nhật từ năm 19 53 -19 60, thiệt hại về năng suất là 2,98%, tính riêng trong năm 4 19 60, thất thu do bệnh cháy... đề Magnaporthe grisea (Hebert) Barr (anamorph, Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae, Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12 ] Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân gây bệnh cháy lá (đạo ôn) trên cây lúa (Oryza sativa), đây là một loại bệnh nghiêm trọng và gây tổn thất lớn đối với các nước trồng lúa trên thế giới Hàng năm, năng suất lúa. .. rằng nấm Magnaporthe grisea có sự đa dạng di truyền trong quần thể [11 ] Một số giả thuyết cho rằng những yếu tố chuyển vị (transposon) [12 ], thể dị hạch (heterokaryosis), và sự tái tổ hợp trong sinh sản hữu tính có thể là nguyên nhân tạo nên sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm M grisea [14 ] Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, Southern . MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa , nhằm phân tích được cấu trúc di truyền giữa các dòng nấm Magnaporthe. grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long. 5.4. Mục đích – Yêu cầu 5.4 .1. Mục đích Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo