BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***** THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp, tơi gặp khó khăn định nhờ hướng dẫn giúp đỡ người khóa luận hồn thành Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt trình học tập trường  TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hồng Phượng Un hết lịng hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực tập tốt nghiệp  Các anh chị Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản anh chị Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Ban Giám đốc anh chị công ty Nam Khoa  Các bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học 27 chia sẻ vui buồn trình học tập giúp đỡ thời gian thực tập iii TĨM TẮT NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)” Thời gian thực từ tháng 03/2005 – 08/2005 Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Mơi trường Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (RIA 2) Đề tài thực đối tượng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh tơm sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm bố trí cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với hợp chất chiết xuất từ thảo dược nồng độ khác nhau, sau kiểm tra tác dụng hợp chất virus WSSV Sau sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu tác dụng hợp chất lên virus WSSV cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất vào thể tơm thí nghiệm Đánh giá tác dụng hợp chất dựa vào kết Reatime PCR tỷ lệ sống tơm thí nghiệm Kết đạt sau thí nghiệm với hợp chất ký hiệu D2, B, M: Ở nồng độ thử nghiệm 2,5 (mg/ml), (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml): Hợp chất M chưa đủ liều lượng để tác dụng lên lớp vỏ protein virus khơng có hiệu tác dụng virus Hợp chất B D2 có tác dụng lên virus WSSV nồng độ 2,5 (mg/ml), (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml) iv MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt vi Mục lục v Danh sách hình viii Danh sách bảng sơ đồ ix PHẤN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tình hình dịch bệnh tơm giới 2.2 Tình hình ni dịch bệnh tôm Việt Nam .4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch tôm sú 2.4 Khái quát bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng tôm sú 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 2.4.2 Khu vực phân bố 2.4.3 Ký chủ 2.4.4 Điều kiện phát sinh đường lây truyền 2.4.5 Cơ chế xâm nhập 2.4.6 Bệnh lý 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến 10 2.5.2 Sơ lược phương pháp PCR Realtime PCR 10 2.6 Một số dạng hợp chất thực vật 11 2.6.1 Alkaloid 11 v 2.6.2 Flavonoid 12 2.7 Một số cơng trình nghiên cứu sử dụng thực vật phòng trị bệnh cho đối tượng thuỷ sản 12 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Vật liệu sinh học 15 3.2.2 Dụng cụ hoá chất 15 3.2.2.1 Dụng cụ hóa chất phịng thí nghiệm 15 3.2.2.2 Dụng cụ hóa chất phịng thí nghiệm ướt 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp ly trích thu dịch chiết virus 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus tôm 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16 3.3.4 Phương pháp PCR 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17 3.3.5 Phương pháp xác định số yếu tố mơi trường 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18 3.4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng 18 3.4.2 Thử nghiệm hợp chất sàng lọc tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus hợp chất vào tôm 19 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng 20 4.1.1 Kết sàng lọc hợp chất D2 20 4.1.2 Kết sàng lọc hợp chất B 21 4.1.3 Kết sàng lọc hợp chất M 23 vi 4.2 Kết thử nghiệm sau tiêm tôm hỗn hợp virus WSSV hợp chất D2, B nồng độ khác 23 4.2.1 Kết thử nghiệm hợp chất D2 27 4.2.2 Kết thử nghiệm hợp chất B 29 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất D2 thời gian 20 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất B thời gian 21 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất M thời gian 22 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất D2 trước thí nghiệm 28 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất D2 sau thí nghiệm 28 H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất B trước thí nghiệm 30 H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất B sau thí nghiệm 30 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG .TRANG Bảng 2.1 Tên số quốc gia năm xuất bệnh đốm trắng Bảng 2.2 Đánh giá khả phát bệnh đốm trắng phương pháp khác 10 Bảng 4.1 Các yếu tố mơi trường q trình thí nghiệm 24 Bảng 4.2 Kết ghi nhận tỷ lệ tơm chết lơ q trình thí nghiệm 25 Bảng 4.3 Kết Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng hàm lượng DNA mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất trước thí nghiệm sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ .TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả tác dụng virus WSSV thể sống tôm sau ủ hỗn hợp virus thuốc thử nồng độ khác 19 ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt sản phẩm thủy sản ngày tăng cao Vì thế, sản lượng thủy sản khơng thể đáp ứng nhu cầu thị trường, nguồn lợi thủy sản ngày giảm khai thác mức Trước tình hình việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt bùng phát nghề nuôi tôm biển thực tế khách quan nhu cầu cần thiết Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta phát triển mạnh vài thập kỷ gần đây, đặc biệt nghề nuôi tôm tỉnh ven biển Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn kỹ thuật ni cịn hạn chế Điều dẫn đến suy thối mơi trường ni bùng phát lây lan dịch bệnh Khoảng 20 năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm Một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng bệnh đốm trắng ( White Spot Desease ) virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Thiệt hại lên đến 100 % quần đàn từ - ngày kể từ phát tơm bệnh Có nhiều phương pháp phòng trị bệnh đốm trắng dùng chế phẩm sinh học, hố chất, thuốc… cịn tồn nhiều mặt hạn chế mức độ thành công chưa cao Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật phong phú Thảo dược từ xưa ứng dụng phịng trị bệnh có hiệu y học thú y Tuy nhiên lĩnh vực thuỷ sản chưa ứng dụng rộng rãi Thử nghiệm số hợp chất thảo dược phòng trị bệnh đối tượng nuôi thuỷ sản hướng nghiên cứu cần khai thác Được đồng ý Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh thầy hướng dẫn, chúng tơi thực khố luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm số hợp chất chiết xuất từ thảo dược phòng trị bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon)” 1.2 Mục đích yêu cầu - Sàng lọc số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) - Thử nghiệm tác dụng hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) điều kiện thí nghiệm 3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh tơm giới Nuôi trồng thủy sản ngành kinh tế quan trọng đóng góp phần đáng kể thị phần xuất số nước giới, đặc biệt nước Châu Á Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia Việt Nam Trong đối tượng ni thuỷ sản tơm đối tượng ni đem lại lợi ích kinh tế nhiều Theo công bố Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO), sản lượng tôm giới thập kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175 % Theo báo cáo hội nghị ni tơm tồn cầu (2003), sản lượng tôm nuôi giới từ 1999 sau: 1.084000 (1999), 1.143000 (2000), 1.291000 (2001), 1.445000 (2002), 1.840000 (2003) Mức tăng bình quân khoảng 10,5 % năm Các lồi tơm ni nhiều tôm sú (P monodon), tôm nương (P chinensis) tôm he chân trắng (P vannamei) Riêng lồi tơm chiếm 86 % sản lượng tơm ni giới Nếu tính sản lượng tơm sú xếp thứ 20 loài thủy sản ni tính giá trị chúng đứng đầu với 4,046 tỷ USD năm 2000 Năm 2000, xuất tôm giới đạt 10,9 tỷ USD Với hiệu kinh tế xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực trở thành nghề sản xuất thu hút nhà đầu tư Sự phát triển mạnh mẽ, nói bùng nổ nghề ni tơm giới ngồi mặt lợi cịn có mặt trái Trong suốt thập kỷ qua, nghề ni tơm giới có nhiều thay đổi trải qua nhiều khó khăn Dịch bệnh liên tiếp xuất nhiều khu vực nuôi tôm giới, đặc biệt nước châu Á, bệnh virus ảnh hưởng nghiêm trọng đến cơng nghiệp ni tơm Ước tính tổng thiệt hại virus gây trung bình hàng năm cho giới khoảng tỷ USD Bệnh virus gây hội chứng đốm trắng tôm sú gây tỷ lệ chết cao gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp nước Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia Ấn Độ Bệnh đốm trắng xuất vào năm 1992 – 1993 Bắc Á, sau khu vực khác giới Tên số quốc gia năm phát bệnh đốm trắng trình bày Bảng 2.1: Bảng 2.1: Tên số quốc gia năm xuất bệnh đốm trắng Tên quốc gia Đài Loan Trung Quốc Ấn Độ Thái Lan Nhật Indonesia Úc Việt Nam Năm phát 1992 1993 1994 1994 1994 1994 1994 1994 Tỷ lệ gây chết virus lên đến 100 % vòng - 10 ngày kể từ có dấu hiệu 2.2 Tình hình ni dịch bệnh tôm Việt Nam Hoạt động nuôi tôm biển ngày đóng vai trị quan trọng nước ta Tôm nước lợ đối tượng nuôi chủ lực tỉnh ven biển Diện tích ni tơm nước lợ đạt 546.757 (2003), diện tích ni thâm canh 15.534 (chiếm khoảng 2,84 % tổng diện tích ni tơm), ni bán thâm canh 20.116 (chiếm 3,67 %), cịn lại ni quảng canh cải tiến quảng canh Năm 2003, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh 32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm Các tỉnh dun hải Nam Bộ có tổng diện tích ni lớn nhất, chiếm 87,17 % nước với 476.528 Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt 200.000 Trong cấu mặt hàng xuất Việt Nam năm 2003, tôm sú mặt hàng chủ lực Khối lượng đạt 123.600 tấn, chiếm khoảng 25 %, giá trị chiếm khoảng 50 %, đạt tỷ USD Theo thống kê Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 báo động tồn quốc dịch bệnh tơm làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng Trong năm 1994, tổng diện tích ni tơm có dịch bệnh 84.558 với sản lượng thiệt hại ước tính 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến dịch bệnh tồn lây lan ngày rộng gây tổn thất nghiêm trọng Đồng Bằng Sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nơi tập trung khoảng 87 % diện tích ni tơm nước Hiện tượng tôm chết hàng loạt tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994 xác định tơm sú có ba loại bệnh MBV, bệnh đốm trắng bệnh đầu vàng (Bùi Quang Tề, 1996, 1997; Nguyễn Việt Thắng CTV, 1998) Trong năm gần đây, bệnh đốm trắng thường xuyên xuất khu vực nuôi tôm ven biển Việt Nam Hầu hết tỉnh tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng làm tôm chết hàng loạt gây tổn thất nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm Mùa xuất bệnh mùa xuân đầu hè thời tiết biến đổi nhiều biên độ nhiệt độ ngày biến thiên lớn (> 5oC) gây sốc cho tôm Bệnh đốm trắng thường gây chết tôm sú, tôm rảo, tôm nương cua, ghẹ Một số tác giả điều tra nghiên cứu diễn biến bệnh đốm trắng tôm Kết cụ thể sau: Ở Việt Nam vào khoảng tháng 2/1994 huyện Bình Đại, Thạnh Phú (Bến Tre) tháng – 4/1994 đầm nuôi cơng ty FIDECO, huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh phát tôm sú bị đốm trắng gây chết hàng loạt tôm nuôi sau 30 – 40 ngày thả nuôi (Lý Thị Thanh Loan, 2003) Theo Nguyễn Việt Thắng cộng tác viên (1996), Tác nhân gây bệnh tơm sú ni thực nghiệm từ 25/10/94 – 25/2/95 tỉnh Nam virus Vi khuẩn xem tác nhân hội gây tác động cộng hưởng Kết nghiên cứu bước đầu qua phân tích mơ học cho thấy có đến - nhóm virus khác gây bệnh cho tôm nuôi miền Nam Việt Nam Năm 2001, Bùi Quang Tề cộng điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phịng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hố, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3 %) mang mầm bệnh đốm trắng tơm ni tơm cua tự nhiên có 169 hộ (34,99 %) bệnh đốm trắng gây tôm chết Tôm sú nuôi sau - tháng bệnh đốm trắng xuất gây tôm chết hàng loạt Tôm sú bố mẹ đánh bắt biển khơi đầm phá có tượng bị bệnh đỏ mang sau đánh bắt - ngày, tỷ lệ chết tới 80 - 100 %, thời gian tôm bị bệnh chết nhiều vào tháng – (sau tết) Kiểm tra kính hiển vi điện tử thấy có xuất thể virus hình que test PCR dương tính với bệnh đốm trắng Năm 2003, phân tích bệnh WSSV kỹ thuật PCR 145 mẫu tôm sú tôm chân trắng (Lipopenaeus vannamei) nuôi tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phịng, Nam Định, Thanh Hố Hà Tĩnh ) tôm post đưa từ Quảng Nam Đà Nẵng chuyển Bắc Kết cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng tôm post đưa từ miền Trung (Đà Nẵng, Quảng Nam) 23,08 %; tôm sú nuôi thương phẩm tỉnh phía Bắc 26,92 %; tơm chân trắng 13,33 % Phân tích tỷ lệ lưu hành bệnh WSSV theo tháng tôm sú nuôi thương phẩm thấy tháng 7, 8, có tỷ lệ nhiễm bệnh cao (0,25 – 0,4); tháng tỷ lệ thấp (0,12) tháng chưa phát thấy tôm nhiễm bệnh Các bệnh tôm xảy chủ yếu virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), ngồi cịn xuất bệnh MBV, bệnh vi khuẩn Vibrio, bệnh ký sinh trùng, dinh dưỡng gần xuất bệnh phân trắng, teo gan tụy vài nơi  ... HỌC ***** THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên... Tháng 8/2005 “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)? ?? Thời gian thực từ tháng 03/2005... khố luận tốt nghiệp: ? ?Thử nghiêm số hợp chất chiết xuất từ thảo dược phòng trị bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon)? ?? 1. 2 Mục đích yêu cầu - Sàng lọc số hợp