BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC ÁNH MAI Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO TRẦN NGỌC ÁNH MAI ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 - iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TPHCM và quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm qua. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Vì vậy xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: - TS. Nguyễn Văn Hảo. - ThS. Ngô Xuân Tuyến. - BSTY Lê Thị Bích Thủy. - Các anh chị phòng Mô Học và phòng PCR thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. - Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm và toàn thể nhân viên Trại Thực Nghiệm Nuôi Thuỷ Sản - Thủ Đức – TPHCM. Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên. Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của thầy cô và các bạn. iv TÓM TẮT Virus WSSV (White spot syndrome virus), thành viên của một họ virus mới tên là Nimaviridae, là một loại virus nguy hiểm đối với tôm penaeids vì khả năng gây chết cao và nhanh. Đề tài này được tiến hành nhằm phát triển một quy trình kiểm nghiệm mới ổn định, chính xác và có độ nhạy cao để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam. Đó là quy trình hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng. Đại học Gent đã phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh. Quy trình này được nghiên cứu để thay đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam. Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X, 1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X. Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30 mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp. So với 2 phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng. Khác với mô học truyền thống, IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết. Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản, mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả. Chính vì những ưu điểm nổi bật đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ chính xác. v ABSTRACT White spot syndrome virus (WSSV), member of a new virus family called Nimaviridae, is an invertebrate virus causing considerable mortality in penaeid shrimp. This study was undertaken to develop a stable, accurate and sensitive monoclonal antibody (mAb)-based immunohistochemistry (IHC) test process for detection of WSSV in Penaeus monodon in Vietnam laboratories. The standard operating protocol for IHC test using the WSSV VP28 mAb 8B7 on paraffin-embedded and frozen section was developed by Gent University. To be more suitable in Vietnam condition, this protocol was modified in some details. Four different concentrations of mAb (standard - 1X, 0.5X, 1.5X and 2X) and three different ones of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (1X, 1.5X and 2X) were tested on paraffin embedded sections from tissues of infected and uninfected black tiger shrimp Penaeus monodon and the standard concentration of mAb still proved to be efficient with the 1.5X concentration of DAB. To compare IHC method with Polymerase Chain Reaction (PCR) and traditional histology about accuracy, sensitivity and economic efficiency, 25 samples of post-larvae tissues and 30 samples of adult tissues of Penaeus monodon were tested with these three methods. Of the three, in some cases, IHC was considered to be the most reliable technique because of the specificity of the WSSV VP28 mAb 8B7. Unlike the traditional histology, IHC is not too dependent on the professionalism of the technicians to recognize the infected cells as the color signal (brown) is very clear and easily seen. Besides, IHC seldom gives false positive and negative signals because the manipulation is simple, the samples are not easily contaminated by various factors in process like PCR and the mAb is highly sensitive. For all of the advantages of IHC, we suggest using this method for WSSV diagnostics on Penaeids in research experiments in which accuracy is the prerequisite. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv ABSTRACT v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Nội dung 2 1.3. Mục đích 2 1.4. Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú 3 2.1.1. Phân loại 3 2.1.2. Phân bố 3 2.1.3. Vòng đời 3 2.1.4. Sinh trưởng 4 2.1.5. Dinh dưỡng 4 2.1.6. Môi trường sống 5 2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam 5 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 6 2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam 6 2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng 9 2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng 9 2.2.2.2. Phân loại và tên gọi 10 2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hoá 11 2.2.2.4. Độc lực 12 2.2.2.5. Hình thái 12 2.2.2.6. Cấu trúc 12 2.2.2.7. Vật chất di truyền 13 2.2.2.8. Đa dạng di truyền 15 2.2.2.9. Vật chủ 16 2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm 17 2.2.2.11. Cơ chế truyền lan 18 2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích 19 2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh 19 2.3. Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác 20 2.4. Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) 21 2.4.1. Lịch sử phát triển 21 vii 2.4.2. Nguyên lý 22 2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) 22 2.4.4. Kháng thể (antibody) 23 2.4.5. Các phương pháp nhuộm 25 2.4.6. Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản 28 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30 3.2. Vật liệu 30 3.2.1. Mẫu xét nghiệm 30 3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC 32 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ 32 3.2.4. Hoá chất 32 3.3. Phương pháp 33 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 33 3.3.2. Quy trình thực hiện 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC 41 4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau 41 4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác nhau 44 4.2. Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả 49 4.2.1. So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC 49 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC 57 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1. Kết luận 59 5.2. Đề nghị 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 6.1. Tài liệu tiếng Việt 61 6.2. Tài liệu tiếng Anh 61 PHỤ LỤC 70 Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm. Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC. viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TPHCM : Thành phố Hồ Chí Minh. ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long. DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride. FAO : Food and Agriculture Organization. IHC : Immunohistochemistry. MBV : Monodon Baculovirus. mAb : monoclonal Antibody. PCR : Polymerase Chain Reaction. ppt : parts per thousand ppm : parts per million WSSV : White Spot Syndrome Virus. YHV : Yellow Head Virus. ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG NỘI DUNG TRANG Bảng 2.1. Các bệnh thường gặp trên tôm penaeids 7 Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng 11 Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 30 Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 31 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 34 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 35 Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả 40 Bảng 4.1. Kết quả thống kê chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm 41 Bảng 4.2. Kết quả thống kê chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm 44 Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb 45 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm 50 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC 51 Bảng 4.6. So sánh ưu khuyết điểm của 3 phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC 57 x DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH HÌNH NỘI DUNG TRANG Hình 2.1. Sơ đồ vòng đời tôm sú 4 Hình 2.2. Sản lượng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng 8 Hình 2.3. Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới 9 Hình 2.4. Virus đốm trắng 12 Hình 2.5. Protein của WSSV 13 Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV 14 Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV 19 Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng 23 Hình 2.9. Các phương pháp nhuộm 26 Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC 36 Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu 37 Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D 43 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và đối chứng (không có mAb) trên mẫu 103 48 Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm Sau khi nhuộm IHC 54 Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và Mô học truyền thống 55 [...]... (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” 1. 2 Nội dung 1. 2 .1 Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú 1. 2.2 So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và tính hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR 1. 3 Mục đích Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch. .. 14 3.822 tấn Tuy nhiên, đến vụ một năm 2002 mức lây nhiễm bệnh là 30 - 60% trên tổng diện tích thả nuôi, mà bệnh đốm trắng do virus đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm và gây tổn thất lớn Trong 1 – 2 năm trở lại đây nghề nuôi tôm đã phát triển tới miền Bắc và trên những vùng nuôi tôm mới này bệnh đốm trắng vẫn xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng 9 2.2.2 Giới thiệu bệnh đốm trắng 2.2.2 .1. .. 2 .1 Đặc điểm sinh học của tôm sú 2 .1. 1 Phân loại Theo hệ thống phân loại của Hothuis (19 80) và Barnes (19 87) tôm sú thuộc Ngành: Arthopoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Lớp ph : Malacostraca B : Decapoda (Mười chân) Bộ ph : Macrura natantia (Bơi lội) H : Penaeidae (Tôm he) Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp 2 .1. 2 Phân bố Theo chiều ngang: Phân bố rộng rãi trên. .. Disease – WSD) do virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây nên, một loại bệnh nguy hiểm do tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 80 – 10 0% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 19 94), khả năng lây nhiễm rất cao, dễ thành dịch bệnh và cho đến hiện nay vẫn chưa có biện pháp phòng và trị hiệu quả Mức thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra đã lên đến hàng trăm tỷ đồng Vấn đề quan trọng là diễn biến bệnh. .. chủ Cho đến nay đã tìm thấy sự hiện diện mầm bệnh đốm trắng (WSSV) trên:  Tôm he :1 5 loài  Các loài tôm khác :7 loài  Cua :1 2 loài  Tôm hùm :9 loài  Copepoda Vật chủ chính: P.monodon; P.japonicus; P.penicillatus; P.chinensis Đã có nhiều báo cáo về nhóm vật chủ của virus gây hội chứng đốm trắng WSSV  WSSV gây nhiễm trên các loài tôm He ở Châu Á nh : Penaeus monodon, P japonicus, P merguiensis,... Nhật (World Shrimp Farming, 19 98) Dịch bệnh do WSSV gây ra thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều quốc gia nh : Ấn Độ (19 94 – 19 95) làm cho nhiều trang trại nuôi lớn phải đóng cửa (Murthy , 19 97), Thái Lan (19 96 – 19 97) với thiệt hại ước tính lên đến 1 tỷ USD, Trung Quốc (19 93) làm sản lượng xuất khẩu tôm từ 11 5.000 tấn năm 19 92 giảm xuống còn 50.000 tấn năm 19 93 (Flegel, 2000) Trong 10 năm trở lại đây, WSSV... trưởng của loài tôm Cửa sông Bờ biển Biển Biển Hình 2. 1: Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon 2 .1. 4 Sinh trƣởng Tôm gia tăng kích thước bằng cách lột bỏ lớp vỏ cũ của cơ thể Solid (19 88) cho biết tôm sú thường lột xác vào ban đêm Thời gian để vỏ mới của tôm con cứng lại cần một vài giờ, ở tôm trưởng thành phải cần 1 đến 2 ngày (Viladolid và ctv, 19 81) 2 .1. 5 Dinh dƣỡng Tôm sú ăn tạp (Hall, 19 62) Giai đoạn... cân bằng dinh dưỡng Bệnh do độc tố Bệnh do môi trường One month death syndrome Zoea syndrome II Do ảnh hưởng của dịch bệnh năng suất tôm toàn cầu trong năm 19 93 chỉ đạt 639.000 tấn, giảm 12 % so với năng suất của năm 19 92 (Lavilla – Pitogo ,19 96) Trong năm 19 94, tổng thiệt hại gây ra do WSD (White Spot Disease) và YHD (Yellow Head Disease) khoảng 1 tỷ USD đối với các nước có nghề nuôi tôm đang phát triển... phát triển và ứng dụng các mô hình nuôi tôm chủ yếu sau: Quảng canh (Extensive culture), quảng canh cải tiến (Improved extensive culture), bán thâm canh (Semi-intensive culture), thâm canh (Intensive culture) và nuôi sinh thái 2.2 Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2 .1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam A Trên thế giới Việc phát triển ồ ạt của nghề nuôi tôm sú trên thế giới... Woongteerasupaya và ctv, 19 95 Tapay và ctv, 19 96 Inouye và ctv, 19 96 Chang và ctv, 19 96 Đài Loan Trung Quốc Thái Lan Đài Loan Wang và ctv, 19 96a Yang và ctv, 19 97 Durand và ctv, 19 97 Lo và Kou, 19 98 2.2.2.3 Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hóa Cũng như đa số các virus, virus gây bệnh đốm trắng WSSV có sức chịu đựng yếu với các yếu tố môi trường Theo Chang và ctv (19 98 ):  Sau 48 –7 2 giờ sau . BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus. BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD). hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” 1. 2. Nội dung 1. 2 .1. Phát triển kỹ thuật hóa