phân hủy phần máu khơ hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy nhiên, mẫu khơng có lẫn protein làm cho hiệu phản ứng PCR giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003) Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ g xuống cịn 100 ng, giảm nồng độ DNA ban đầu hạn chế khuếch đại “kí sinh” tạo sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Việc sử dụng nồng độ DNA cao tạo kết dương tính giả 2.3.2.2 Primer nhiệt độ lai Primer yếu tố định đến hiệu khuếch đại phản ứng PCR Một phản ứng PCR chuẩn gồm loại primer: primer xuôi primer ngược Trong đó, primer xi bắt cặp bổ sung sợi sen, primer ngược bắt cặp sợi antisen phân tử DNA mẫu Việc thiết kế primer đòi hỏi phải đáp ứng nhu cầu sau: - Trình tự primer chọn cho khơng có bắt cặp bổ sung primer xi primer ngược, khơng có cấu trúc “kẹp tóc” bắt cặp bổ sung thành phần khác primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) - Thành phần nucleotide phải cân Nếu tỉ lệ G, C cao số lượng nucleotide primer giảm từ 15- 30 nu xuống 18 – 20 nu (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) Tỉ lệ nu ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt cặp primer, nhiệt độ tính theo cơng thức: Tm = x (A + T) + x (G + C) Đồng thời nhiệt độ bắt cặp hai primer khơng cách biệt q xa - Trình tự khuếch đại trình tự DNA nằm hai primer xi ngược, trình tự khơng lớn Phải nhỏ Kb phản ứng PCR chuẩn (Khuất Hữu Thanh, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005) - Các primer phải đặc trưng cho trình tự khuếch đại, khơng bắt cặp bổ sung với nhiều trình tự hệ gene Trong phản ứng PCR nồng độ primer khoảng – 25 pM cho phản ứng 25 – 50 l (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.3.2.3 Enzyme Enzyme sử dụng lần đoạn Klenow DNA polymerase I (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Tuy nhiên, hiệu mang lại không cao enzyme bị bất hoạt nhiệt độ cao Việc phát minh sử dụng enzyme Taq DNA polymerase phản ứng PCR bước ngoặc quan trọng thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) Enzyme Taq polymerase chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus Đây vi khuẩn sống suối nước nóng, chịu nhiệt độ cao Enzyme Taq polymerase thu từ vi khuẩn chịu đựng nhiệt độ cao, đặc điểm phù hợp với điều kiện phản ứng PCR 2.3.2.4 Mg2+ Là thành phần dung dịch đệm, chất xúc tác enzyme DNA polymerase Do đó, Mg2+ ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR Nồng độ cao hay thấp Mg2+ ảnh hưởng lớn đến hoạt động enzyme Taq polymerase, ảnh hưởng đến trình tách mạch đơn phân tử DNA Nếu nồng độ enzyme thấp ức chế hoạt động enzyme, nồng độ cao giúp mạch kép DNA ổn định lại ức chế biến tính hồn tồn chuỗi DNA Nồng độ Mg2+ mức cao dẫn đến bắt cặp sai primer khuôn Nồng độ tối ưu Mg2+ cho phản ứng phải xác định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) 2.3.2.5 dNTPs Nồng độ thành phần nucleotide ảnh hưởng đến kết PCR Nồng độ dNTPs thường sử dụng 20 – 200 M Nồng độ dNTPs cao dẫn đến khuếch đại “ký sinh” Sự cân thành phần nucleotide làm tăng lỗi chép DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) 2.3.2.6 Số lƣợng chu kỳ Tuy mặt lý thuyết số lượng chu kỳ khơng giới hạn, thực tế số lượng chu kỳ thường không vượt 40 chu kỳ Khi số lượng chu kỳ lớn hiệu phản ứng PCR bị giảm theo số lượng chu kỳ Nguyên nhân việc giảm hiệu phản ứng PCR nhiều, ví dụ việc cạn kiệt thành phần phản ứng, xuất sản phẩm phụ… Do nhiều lý vậy, nên việc xác định số lượng chu kỳ phụ thuộc nhiều vào số lượng mẫu ban đầu 2.3.2.7 Nhiệt độ pH Do liên kết hydro phân tử DNA nhạy cảm với nhiệt độ nên việc xác định nhiệt độ cho phản ứng PCR vơ quan trọng Với mục đích biến tính DNA thường sử dụng nhiệt độ từ 94 – 96oC Cịn giai đoạn bắt cặp nhiệt độ thường sử dụng 50 – 56oC, nhiên nhiệt độ cịn tùy thuộc vào đặc tính primer (tỉ lệ G, C) Nếu tỉ lệ G, C cao nhiệt độ bắt cặp cao theo Ở nhiệt độ 72oC enzyme Taq polymerase hoạt động tốt hiệu kéo dài cao Trong phân tử DNA, pH ảnh hưởng đến liên kết phosphodiester Khi mơi trường có pH = DNA ổn định nhờ bền vững liên kết Cịn pH acid liên kết bị phá vỡ Tuy nhiên, pH phản ứng PCR thay đổi từ 6,8 – 7,8 2.3.2.8 Thiết bị dụng cụ phản ứng PCR Yêu cầu thiết bị phản ứng PCR phức tạp Các thiết bị phải chịu nhiệt độ, chịu biến thiên liên tục nhiệt độ phải tránh tối đa thoát nước phản ứng PCR Mọi dụng cụ dùng phản ứng PCR phải hoàn toàn để tránh tạp nhiễm Dụng cụ phải chịu nhiệt độ, chịu biến thiên nhiệt độ phải truyền nhiệt tốt… 2.3.3 Các bƣớc thực phản ứng PCR Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm giai đoạn: biến tính, giai đoạn lai, giai đoạn kéo dài - Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denature) Trong giai đoạn phản ứng PCR đưa lên nhiệt độ 94 – 96oC thời gian 30 – 60 giây Ở nhiệt độ phân tử DNA tách thành hai chuỗi đơn - Giai đoạn 2: Giai đoạn lai (annealing) Nhiệt độ phản ứng hạ xuống khoảng 40 – 70oC, tùy thuộc vào Tm primer Ở nhiệt độ này, primer bắt cặp với khuôn DNA Thời gian cho bắt cặp từ 30 – 60 giây - Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (extension) Thông thường nhiệt độ cho giai đoạn 72oC, nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme Taq polymerase Enzyme giúp kéo dài mạch phân tử DNA từ primer Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào chiều dài phân tử DNA Nhưng thường thay đổi từ 30 giây đến vài phút Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm giai đoạn, chu kỳ lặp lặp lại nhiều lần Mỗi lần lặp lại lượng DNA tăng gấp đôi Như lượng DNA khuếch đại theo hàm số mũ: M = m 2n Trong đó: M: lượng DNA sau khuếch đại m: lượng DNA mẫu ban đầu n: số chu kỳ phản ứng PCR 2.3.4 Ƣu nhƣợc điểm phản ứng PCR Ưu điểm phản ứng PCR: - Thời gian thực nhanh, đơn giản, tốn - Khơng địi hỏi mẫu phải tinh cao Nhược điểm phản ứng PCR: - Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotide đoạn DNA cần khuếch đại, hay chí phải biết trình tự hai đầu phân tử DNA - Chỉ khuếch đại phân tử DNA có kích thước nhỏ Kb, tốt Kb - Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dương tính giả) 2.3.5 Ứng dụng kỹ thuật PCR Do có khả khuếch đại lượng DNA cực nhanh chuyên biệt nên kỹ thuật PCR áp dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực - Sản xuất mẫu dò Trước kỹ thuật PCR đời, việc sản xuất mẫu dò đòi hỏi phải qua nhiều giai đoạn phức tạp như: tạo dịng, ni cấy, sử dụng nick translation hay random priming… Khi kỹ thuật PCR đời việc tạo mẫu dị đơn giản nhiều, đồng thời sản xuất số lượng lớn mẫu dò - Ứng dụng khuếch đại DNA, RNA - Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền - Ứng dụng chẩn đốn bệnh Kỹ thuật PCR nhạy, với hay nhiều cặp primer ta xác định sinh vật gây bệnh thông qua đặc trưng hệ gene chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1995) 2.4 Giới thiệu kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) 2.4.1 Sơ lƣợc enzyme cắt giới hạn 2.4.1.1 Giới thiệu chung Enzyme cắt giới hạn endonuclease có khả thủy giải DNA sợi đôi cách đặc hiệu lặp lại trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Nó đóng vai trị quan trọng phân tích hệ gene, xem công cụ thiếu để thực kỹ thuật DNA tái tổ hợp Trong giới loài vi khuẩn, vi khuẩn bị thực khuẩn thể xâm nhiễm số dịng vi khuẩn có khả tự bảo vệ hệ thống R – M Hệ thống có chất enzyme cắt giới hạn Nó cắt sợi DNA vị trí chuyên biệt phân tử DNA ngoại sinh khơng cắt gene Do enzyme có đặc tính có tên enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) Hệ thống R – M bảo vệ sợi DNA cách làm biến đổi (modification) thành phần hóa học phân tử DNA Phân tử gắn thêm nhóm methyl vào A C vị trí enzyme cắt giới hạn Khi vị trí A C bị methyl hóa, enzyme cắt giới hạn khơng cịn nhận biết vị trí cắt Do vi khuẩn tránh bị enzyme RE cắt hệ gene chúng 2.4.1.2 Tên gọi enzyme cắt giới hạn Tên gọi thống cho enzyme cắt quy định sau: - Chữ đầu viết hoa chữ đầu tên giống vi khuẩn dùng để ly trích enzyme RE - Hai chữ kế khơng viết hoa tương ứng với lồi vi khuẩn nói - Tiếp theo chữ số la mã thứ tự RE phát (trong trường hợp nhiều RE tìm thấy lồi vi khuẩn) Đơi cịn sử dụng chữ viết hoa để chủng vi khuẩn sử dụng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Ví dụ: Ry13 viết tắt EcoR Escherichia coli Giống Loài Chủng Bảng 2.1: Một vài RE vị trí phân cắt Trình tự Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzyme 5’ – 3’ 3’ – 5’ Haemophilus aegyptius HaeIII GG/CC CC/GG Staphylococcus aureus 3A Sau3AI GATC CTAG Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G/GATCC CCTAG/G Escherichia coli RY13 EcoRI G/AATTC CTTAA/G Haemophilus influenzae Rd HindIII A/AGCTT TTCGA/A Providencia stuartii PstI CTGCA/G G/ACGTC Seratia marcesens SmaI CCC/GGG GGG/CCC Xanthomonas malvacearum XmaI C/CCGGG GGGCC/C (Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) 2.4.1.3 Các loại RE Do đặc tính nhận biết cắt DNA vị trí khác nhau, người ta chia enzyme cắt giới hạn thành loại: - Loại 1: Khi enzyme nhận biết trình tự cắt, di chuyển phân tử DNA đến cách khoảng 1.000 – 5.000 nu giải phóng độ vài chục nu - Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự cắt ln trình tự - Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự đặc trưng cắt DNA vị trí cách khoảng 20 nu Tuy có loại enzyme cắt giới hạn có loại sử dụng nghiên cứu sinh học phân tử 2.4.1.4 Ứng dụng enzyme RE Ở sinh vật nhân thật, việc phân tích hệ gene khó khăn Do việc sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt nhỏ gene khổng lồ cần thiết để dễ dàng nghiên cứu Các nhà khoa học sử dụng RE nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn, lập đồ giới hạn hay so sánh gene loài khác kỹ thuật RFLP 2.4.2 Sơ lƣợc phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.4.2.1 Giới thiệu chung RFLP phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn (RE) để cắt mẫu DNA, sau so sánh số band DNA tạo thành thông qua kỹ thuật điện di để xác định đột biến điểm hay khác trình tự DNA Khi trình tự DNA hai cá thể hồn tồn khác kích thước số lượng thực cắt enzyme cho số vạch kích thước vạch khác Do đó, dựa vào kích thước số lượng band khác nhau, ta xác định có khác trình tự đoạn DNA nghiên cứu 2.4.2.2 Quy trình thực phản ứng RFLP Một phản ứng RFLP chuẩn bao gồm bước sau: - Bước 1: Tách chiết DNA tinh DNA - Bước 2: Cắt mẫu DNA enzyme cắt giới hạn RE - Bước 3: Điện di thực phản ứng lai Southern blot Tuy nhiên, thực phản ứng RFLP cần phải thực phản ứng trung gian Southern blot (Hình 2.2) Do kỹ thuật tốn phức tạp Hình 2.2: Mô tả phản ứng RFLP (Nguồn: http://www.agronomy.ucdavis.edu) 2.4.3 Sơ lƣợc kỹ thuật RFLP – PCR Do phức tạp, tốn khó khăn phải thực Southern blot nên nghiên cứu gene người ta thường thực phản ứng RFLP dựa PCR Phương pháp thực sở khuếch đại có chọn lọc đoạn DNA PCR Sau tiến hành phân cắt sản phẩm PCR enzyme thích hợp Dựa vào kết cắt sản phẩm PCR enzyme cắt để đánh giá đa hình DNA Ưu điểm lớn phương pháp thiết kế probe Đồng thời phương pháp tạo band phương pháp RFLP nguyên thủy, tạo điều kiện dễ dàng phân tích kết Quy trình thực hiện: - Tách chiết DNA - Thực PCR khuếch đại trình tự đích cặp primer thích hợp - Xử lý sản phẩm PCR enzyme cắt giới hạn - Điện di nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết Ngoài ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thơng thường phương pháp RFLP – PCR cịn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết điện di trực tiếp mắt khơng dùng đồng vị phóng xạ mà sử dụng ánh sáng huỳnh quang để đọc kết 2.5 Giới thiệu vùng ITS Vùng ITS vùng nằm xen kẽ với trình tự rDNA (Hình 2.3) Các trình tự rDNA mã hóa cho rRNA, rRNA kết hợp với protein để tạo ribosome có chức tổng hợp protein Trong vùng vùng rDNA vùng bảo tồn nhất, vùng ITS vùng biến động vùng IGS Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS nấm (Nguồn: http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/) Đặc điểm vùng ITS (Bridge cộng sự, 2000): - Đây vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch đại phản ứng PCR - Vùng ITS có tính bất ổn vùng gene mã hóa rDNA - PCR khuếch đại vùng primer đặc trưng Các nhà nghiên cứu lựa chọn vùng ITS để tìm vùng gene đặc trưng cho lồi, từ giúp xác định lồi nhanh chóng Do tính chất mà vùng ITS sử dụng nghiên cứu với mục đích tìm xác định đa dạng di truyền nhiều loài nấm (Carbone Kohn, 1993; Hallenberg cộng sự, 1996; Hirata Takamatsu, 1996) Năm 1996, Edel cộng tiến hành phân tích RFLP vùng ITS tìm vài khác biệt nấm Fusarium oxysporum Hiện nay, nhà khoa học sử dụng nhiều kỹ thuật PCR, RFLP, DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga cộng sự, 1997) Đối với loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn cao dịng nấm có quan hệ di truyền gần gũi Ngồi việc sử dụng vùng ITS để phân tích phát sinh lồi, cịn sử dụng với mục đích phát định danh vi sinh vật (Vandepeer cộng sự, 1996) Tuy nhiên, thông thường người ta sử dụng vùng ITS để xác định biệt hóa loài (Guarro, 1999) Nazar cộng (1991) sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS để phát định danh nấm Verticillium albo-atrum V dabliae Trong nghiên cứu tương tự dòng Verticillium tricorpus, Moukhamedov cộng (1993) định danh chúng thuộc loài Verticillium Trước đây, người ta phân loại chủ yếu dựa đặc điểm hình thái, chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào thành phần protein nên kết thường có độ tin cậy không cao Với việc phát triển kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử vùng ITS, người ta phân loại dịng nấm cách xác Năm 1996, Boysen cộng sử dụng PCR vùng ITS1, ITS2 nấm Rhizoctonia solani để phân tích đặc tính bệnh xác định nhóm phụ Với ưu điểm vậy, vùng ITS ngày nghiên cứu rộng rãi phổ biến Nó vùng đạt kết nhiều nghiên cứu sinh học phân tử nấm 2.6 Một số nghiên cứu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei nƣớc nƣớc Đã có nhiều nghiên cứu nấm Corynespora cassiicola Tuy nhiên, loại nấm bùng phát nên đa số nghiên cứu nghiên cứu hình thái, khả gây bệnh, khả sinh độc tố cassiicoline phân bố chúng nhiều lãnh thổ khác Những nghiên cứu làm thay đổi cách đánh giá khả gây bệnh loài nấm Kết nghiên cứu cho thấy nấm Corynespora cassiicola có phổ ký chủ rộng, đồng thời khả sinh độc tố thay đổi lớn tùy thuộc vào dịng vơ tính cao su ghi nhận (Jayashinge cộng sự, 1998) Hiện nay, Việt Nam nghiên cứu nấm C cassiicola chưa nhiều Ngoài nghiên cứu hình thái, khả gây bệnh cịn có nghiên cứu khả kháng bệnh số dịng vơ tính cao su Vũ Thị Quỳnh Chi (2005) sử dụng enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III, Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền dòng nấm C cassiicola (RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết khơng tìm thấy đa hình cắt enzyme giới hạn Trên giới có nhiều nghiên cứu loại nấm Đa số nghiên cứu tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả gây bệnh… chúng Kết nghiên cứu chứng minh loài nấm nguy hiểm, có khả bùng phát diện rộng Ngồi khả sinh độc tố, nấm cịn có khả tổng hợp enzyme phân hủy peptin cellulose (C.K Jayashinge, 2000) Năm 1995, Silva cộng sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích khác biệt mặt di truyền 42 dòng nấm C cassiicola khác phân thành chủng nấm khác xếp chúng vào nhóm di truyền Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR sử dụng để nghiên cứu đa hình dịng nấm Năm 2003, Safiah Atan Noor Hisham Hamid sử dụng kỹ thuật RAPD RFLP – PCR để phân tích khác biệt mặt di truyền dòng nấm Kết xếp chúng vào chủng nghiên cứu RAPD Kết phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR cho thấy khơng có sai khác đáng kể dòng nấm nghiên cứu Năm 1998, Silva cộng dùng kỹ thuật RAPD phân tích RFLP vùng ITS 32 dịng nấm Ơng khơng tìm thấy đa hình nghiên cứu kỹ thuật RFLP –PCR, với kỹ thuật RAPD phân 32 dịng nấm thành nhóm di truyền PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian, địa điểm đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Tiến hành từ tháng 02/2006 đến tháng 08/2006 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu - Phân lập tách đơn bào tử phịng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam – Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương - Nhân sinh khối nấm C cassiicola Phịng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp HCM - Tiến hành ly trích DNA, chạy PCR, RFLP Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp HCM 3.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu dịng vơ tính cao su có triệu chứng bệnh rụng Corynespora 3.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS Phân tích đa dạng di truyền nấm C cassiicola kỹ thuật RFLP – PCR 3.3 Vật liệu phƣơng pháp 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, giấy thấm, bơng gòn, giá để ống nghiệm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, máy lắc, bút lông… Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar Thuốc nhuộm Methylene Blue Nước cất Cách pha môi trƣờng PGA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất lần đun sôi 30 phút Lọc lấy nước Thêm 15g agar 500 ml nước cất vào dung dịch lọc Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml thêm 20g đường glucose Đun sôi 30 phút, khuấy lúc nấu Phân vào đĩa petri ống nghiệm (10 ml/ ống) đem hấp khử trùng 121 C/ 15 phút 3.3.1.2 Phƣơng pháp lấy mẫu Lấy nguyên mẫu có triệu chứng bệnh, đặt hộp đựng mẫu có giấy thấm nước để giữ ẩm Mẫu ghi đầy đủ liệu như: nơi lấy mẫu, dịng vơ tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, non, già, triệu chứng đặc trưng (hình xương cá) hay khơng đặc trưng (vết trịn)…) 3.3.1.3 Phƣơng pháp phân lập nấm Mẫu nấm phân lập từ vết bệnh đặc trưng không đặc trưng bệnh rụng Corynespora theo bước sau: - Mẫu đưa phịng thí nghiệm rửa nước cất vơ trùng lần - Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử cấy vào môi trường PGA Hoặc cắt mẫu thành miếng nhỏ, rửa nước cất vô trùng, cồn 70o cấy vào môi đĩa môi trường PGA - Ủ hai ngày Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường - Tiếp tục cấy truyền đến thu giống nấm chủng Tiến hành quan trắc bào tử nấm C cassiicola Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử 3.3.1.4 Phƣơng pháp tách đơn bào tử Sau phân lập dòng nấm C cassiicola chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử Quy trình tách đơn bào tử thực sau: - Dùng kim mũi mác cạo nhẹ bề mặt khuẩn lạc nấm - Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng - Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải lớp mỏng agar - Ủ nhiệt độ phòng 12 - Tiến hành quan sát kính hiển vi, tìm bào tử nảy mầm riêng rẽ mọc tách riêng rẽ Đánh dấu, sau tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA - Đem ủ nhiệt độ phòng – ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc 3.3.1.5 Phƣơng pháp nhân sinh khối - Chuẩn bị môi trường PGA lỏng, cách pha giống với môi trường PGA (Mục 3.3.1.1) không bỏ agar - Sau thu khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối môi trường PGA lỏng Nhân sinh khối nấm cách lắc máy lắc (160 vòng/phút, 26 – 30oC) - Sa u ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm cách lọc giấy lọc tiệt trùng Sau làm khô sinh khối, giữ -20oC 3.3.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA nấm 3.3.2.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm - Nitơ lỏng - Isoamyl alcohol - Phenol - Isopropanol - Chloroform - Ethanol 100%, 70% - TE 1X: 10 mM Tris HCl + mM EDTA, pH = 8,0 - Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% mecaptoethanol - Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex… 3.3.2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA DNA nấm tách chiết theo phương pháp Lee & Taylor (1990) Quy trình cụ thể - Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền dung dịch nitơ lỏng - Chuyển bột nghiền vào eppendorf - Thêm 300 l lysis buffer, trộn Nếu hỗn hợp đặc cho thêm lysis buffer - Ủ 65oC 1giờ - Di chuyển ống nghiệm khỏi bồn ổn nhiệt - Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ - Ly tâm 14.000 vòng phút nhiệt độ 28oC - Chuyển dịch (khoảng 300 l) vào eppendorf - Kết tủa DNA cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ - Ly tâm 14.000 vòng phút 28oC - Loại bỏ dịch lỏng Dùng ethanol 70o rửa nhiều lần - Làm khơ DNA, hịa tan dung dịch TE 1X tồn trữ 4oC hay -20oC 3.3.2.3 Định tính DNA kỹ thuật điện di Sau thu DNA sợi nấm, tiến hành chạy điện di kiểm tra DNA tổng số với mục đích định tính DNA nấm Chạy kiểm tra DNA tổng số gel agarose 0,8% 3.3.2.4 Tinh sản phẩm ly trích Sản phẩm DNA tổng số ly trích có nhiều tạp nhiều nguyên nhân protein khử không hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy… tinh trước đem chạy PCR Quy trình tinh sản phẩm DNA tổng số thực theo quy trình sau: - Bước 1: Pha lỗng mẫu ly trích với nước cất vô trùng theo tỷ lệ mẫu : nước - Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu l enzyme RNase Đem ủ 37oC 30 phút - Bước 3: Sau ủ, hút l hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ - Bước 4: Đem ly tâm hỗn hợp 13.500 vòng, thời gian phút Tiến hành hút dịch cho vào eppendorf khác - Bước 5: Cho vào eppendorf chứa dịch 400 l ethanol 100% ủ -70oC, 20 phút - Bước 6: Ly tâm hỗn hợp 13.500 vòng, thời gian phút - Bước 7: Loại bỏ dịch Tiến hành làm khô mẫu cho TE 1X vào 3.3.3 Khuếch đại vùng ITS nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei kỹ thuật PCR 3.3.3.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm primer: ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC Dụng cụ thí nghiệm: Eppendorf loại Micropippette đầu típ loại Lị vi sóng Cân kỹ thuật số Máy luân nhiệt (thực phản ứng PCR) 3.3.3.2 Thực phản ứng PCR Bảng 3.1: Thành phần phản ứng PCR Thành phần dNTP 10X PCR buffer MgCl2 ITS A ITS B Taq polymerase Liều lượng phản ứng ( l) 0,5 2,5 1 0,1 Nồng độ đầu Nồng độ cuối 10 mM 0,2 mM 10 X 1X 25 mM mM 25 pM/ l 25pM 25 pM/ l 25pM 5U 0,5U Khuôn mẫu Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: thực 41 chu kỳ - Chu kỳ 1: Biến tính: 94 C Bắt cặp: 51 C phút Kéo dài: 72 C - 3phút phút 39 chu kỳ tiếp theo: Biến tính: 94 C Bắt cặp: 51 C phút Kéo dài: 72 C - phút phút chu kỳ cuối: Biến tính: 94 C 1phút Bắt cặp: 51 C phút Kéo dài: 72 C phút 3.3.3.3 Điện di sản phẩm PCR đánh giá kết điện di Sản phẩm PCR kiểm tra cách điện di gel agarose 1% Hóa chất cho kỹ thuật điện di DNA ladder loại 1000bp (Biorad) Ethidium bromide 1% Dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris HCl, 10 mM glacial acetate, EDTE mM) - Loading buffer 6X, gel agarose Dụng cụ thiết bị điện di Micropippette đầu típ Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad) UV transilluminator (Biorad) Máy chụp ảnh (DNA photography equipment) (Biorad) Cách thực đổ gel chạy điện di - Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X - Đun sôi khoảng – phút - Để nguội đến 40 – 50oC - Đổ gel vào bể điện di đặt lược tạo giếng diện di - Chờ gel đông lại Cho vào bể điện di đổ dung dịch TAE vào - Lấy l sản phẩm PCR trộn với l loading dye cho vào giếng tiến hành chạy điện di - Phân tích sản phẩm PCR máy chụp gel 3.3.4 Phân tích RFLP vùng ITS dịng nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 3.3.4.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm Các enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I, Nde II, Sau 3A I, EcoR I, Cfo I, Rsa I - Sản phẩm PCR vùng ITS nấm C cassiicola - Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad) - Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml 3.3.4.2 Thực phân tích RFLP Bảng 3.2: Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối Enzyme 0,1 10 U/ l 1U Buffer enzyme 2,5 10 X 1X Sản phẩm PCR Nước vừa đủ phản ứng 25 l Các bước để thực phản ứng enzyme cắt: - Hút l dung dịch sản phẩm PCR cho vào eppendorf - Sau cho 0,1 l dung dịch enzyme cắt vào - Ủ 37oC thời gian khoảng – 14 tùy thuộc vào yêu cầu loại enzyme - Làm bất hoạt enzyme nhiệt độ 65oC thời gian 15 phút Sau đó, sản phẩm cắt kiểm tra cách điện di gel agarose 1% - 1,5%, phân tích đa dạng di truyền dòng nấm PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola số dịng vơ tính cao su 4.1.1 Diễn biến mức độ gây hại tác nhân gây bệnh rụng Corynespora Tác nhân gây bệnh rụng Corynespora nấm Corynespora cassiicola Đây loại nấm có phổ ký chủ rộng, có khả thích nghi lớn với thời tiết Do vậy, bệnh xuất quanh năm thời tiết khí hậu từ cận xích đạo, xích đạo ơn đới Đặc biệt mùa mưa, nước mưa làm bào tử chúng phát tán mơi trường Do có khả thích nghi vậy, nấm Corynespora cassiicola có khả biến đổi sinh hóa lớn Chúng gây bệnh nhiều dịng vơ tính cao su Nấm gây hại cao su tất giai đoạn từ vườn ươm, vườn kiến thiết hay vườn khai thác Ở Việt Nam, bệnh phát cao su vào năm 1999 Và bước đầu ngăn chặn cách chặt bỏ dịng vơ tính bị nhiễm Đồng thời khuyến cáo khơng trồng dịng vơ tính cao su có tính mẫn cảm cao Theo đánh giá nhà nghiên cứu Việt Nam bệnh giai đoạn ủ bệnh tích lũy bệnh, tương lai bùng phát thành dịch bệnh khơng có biện pháp quản lý kiểm sốt bệnh (Phan Thành Dũng – Báo cáo cơng tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, trạng thách thức mới, 2006) Bệnh rụng Corynespora bệnh xuất hiện, quy mô gây hại tiềm ẩn lớn Chúng ta phải thường xuyên kiểm tra tất vườn cao su từ vườn ươm đến vườn khai thác Hiện nay, theo số liệu thống kê Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam hầu hết vườn tuyển non vườn sơ tuyển Lai Khê bị nấm công quy mơ lớn (Bảng 4.1) Bảng 4.1: Tình hình nhiễm bệnh số vƣờn địa bàn Lai Khê – BD Số dịng Phần trăm Ngày vơ tính có triệu dịng vơ quan trắc quan trắc trứng tính bị bệnh Tên vƣờn Số dòng bệnh (%) Vƣờn tuyển non năm 2001 29/05/2006 1131 1005 88,9 Vƣờn tuyển non năm 2002 29/05/2006 1808 1720 95,1 Vƣờn sơ tuyển năm 2003 17/04/2006 72 44 61,1 Vƣờn sơ tuyển năm 2004 18/04/2006 74 47 63,5 Theo Bảng 4.1, tỷ lệ dịng vơ tính cao su bị nhiễm bệnh lớn Tại vườn tuyển non, tỷ lệ nhiễm bệnh cao lý giải số lượng dịng vơ tính lớn khỏang cách gần Do bệnh dễ dàng lây lan dòng với Còn vườn sơ tuyển, vườn lưu trữ giống có tiềm qua chọn lọc nên tỷ lệ nhiễm bệnh có thấp vườn tuyển non Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm bệnh cao, cần có biện pháp hợp lý để hạn chế phát triển bệnh Theo thống kê chưa đầy đủ, công ty cao su trực thuộc Tổng công ty cao su Việt Nam bệnh rụng Corynespora xuất gây thiệt hại lớn cao su Trong q trình tiến hành làm thí nghiệm, tơi tiến hành thu thập mẫu nấm từ mẫu có triệu chứng bệnh nhiều dịng vơ tính cao su khác Vườn tuyển non Lai Khê - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam (Hình 4.1) Để đơn giản thuận tiện cho công việc tiến hành mã hóa tên dịng nấm thu từ dịng vơ tính khác thành số thứ tự (xem Phụ lục 1.) A B C D Hình 4.1 Triệu trứng bệnh rụng Corynespora A: Lá bị bệnh C: Triệu trứng thân non B: Lá bị bệnh nặng D: Tán bị bệnh rụng Corynespora (Nguồn: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN) 4.1.2 Kết phân lập Sau thu mẫu bệnh từ dịng vơ tính khác nhau, tiến hành phân lập nấm môi trường PGA Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm C cassiicola mơi trƣờng nhân tạo (3 ngày sau cấy) Triệu chứng nấm gây cao su biến thiên lớn Từ dạng hình xương cá gân (triệu chứng đặc trưng), đến hình trịn phiến (triệu chứng khơng đặc trưng) Từ mẫu có triệu chứng bệnh tiến hành phân lập phương pháp cấy chuyền nhiều lần Sau chọn khuẩn lạc đặc trưng màu xám nâu, hình dạng khuẩn lạc tập hợp nhiều vòng tròn đồng tâm… Sau tiến hành phân lập thu tổng cộng 65 dòng nấm 65 dịng vơ tính cao su khác A B Hình 4.3: Bào tử nấm C cassiicola A: Bào tử nấm C.cassiicola môi trƣờng tự nhiên B: Bào tử nấm C.cassiicola môi trƣờng nhân tạo (Nguồn: Phan Thành Dũng, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN) ... lập tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS Phân tích đa dạng di truyền nấm C cassiicola kỹ thuật RFLP – PCR 3.3 Vật liệu phƣơng pháp 3.3.1 Phân lập, tách đơn... PCR để phân tích khác biệt mặt di truyền 42 dòng nấm C cassiicola khác phân thành chủng nấm khác xếp chúng vào nhóm di truyền Ngồi kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR sử dụng để nghiên cứu đa hình... sản phẩm PCR trộn với l loading dye cho vào giếng tiến hành chạy điện di - Phân tích sản phẩm PCR máy chụp gel 3.3.4 Phân tích RFLP vùng ITS dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 3.3.4.1