B GIO DC V O TO Trường Đại học Vinh o0o TRẦN ĐĂNG THẠCH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ NA (ANNONACEAE) VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO, HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RÉT CỦA MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC Chuyên ngành: Hoá Hữu Mã số: 60.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HỐ HỌC Vinh - 2012 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: 1, PGS.TS Nguyễn Văn Hùng 2, PGS.TS Lê Văn Hạc Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Hải Nam Phản biện 3: PGS.TS Phan Minh Giang Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Trường Đại học Vinh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Trung tâm thông tin Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Hiện môi trường sống bị nhiễm nghiêm trọng, ngày có nhiều bệnh nguy hiểm bệnh ung thư, HIV Nhiều bệnh gây nên đại dịch cho nhân loại dịch cúm H5N1, H1N1 Ngoài ra, vấn đề kháng thuốc loại virus thách thức lớn với người Để phòng ngừa chữa trị loại bệnh nguy hiểm này, loài người ln cần biệt dược có khản điều trị hiệu tránh kháng thuốc Hiện có khoảng 60% loại thuốc có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên Vì vậy, hóa học hợp chất thiên nhiên nói chung đặc biệt hóa học hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng quan tâm đặc biệt nhà khoa học Tiếp tục theo đuổi hướng nghiên cứu trên, khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế Pháp-Việt: "Nghiên cứu hoá thực vật thảm thực vật Việt Nam", chúng tơi thử hoạt tính sinh học dịch chiết số loài họ Na Kết cho thấy, dịch chiết EtOAc Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre), ức chế 67,5 % dòng tế bào ung thư KB nồng độ g/ml Dịch chiết EtOAc Lãnh công lông mượt (Fissistigma villosissimum Merr) thể hoạt tính chống sốt rét ký sinh trùng Plasmodium facilparum (ức chế 58,3 % nồng độ g/ml) Vì chúng tơi chọn đề tài: ''Nghiên cứu thành phần hoá học số thuộc họ Na (Annonaceae) khảo sát hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống sốt rét số chất phân lập được'' 2 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre) Lãnh công lông mượt (Fissistigma villossimum Merr) Nhiệm vụ nghiên cứu - Thu mẫu cây, xử lý, bảo quản định danh đối tượng nghiên cứu - Ngâm, chiết mẫu thực vật để thu cao tương ứng - Phân lập chất từ cao thu - Xác định cơng thức hố học hợp chất tách - Thử hoạt tính sinh học dịch chiết, số chất phân lập Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp chiết với dung môi hữu để thu cao - Các phương pháp sắc ký, kết tinh, để tách chất - Các phương pháp phổ chứng minh công thức cấu tạo hợp chất tách từ đối tượng nghiên cứu - Các phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào, chống sốt rét Ý nghĩa khoa học thực tiễn, đóng góp luận án Luận án phân lập xác định 44 hợp chất có hai đối tượng nghiên cứu, có chất chất lần phân lập tự nhiên - Đây lần Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre) Quỳ châu - Nghệ An nghiên cứu thành phần hoá học phân lập 29 hợp chất, bao gồm 12 ancaloit, amino axit, hợp chất styryllacton 10 hợp chất khác - Trong số 29 hợp chất phân lập từ Giác đế miên có ancaloit hợp chất có tên 7β,11-dihydroxy-1,2,10-trimetoxynoraporphin, amino axit là: axit 3-amino-4,5-dihydroxy-7phenyl-6-heptenoic chất lần đầu phân lập tự nhiên 3,5demetoxypiperolide - Đây lần Lãnh công lông mượt (Fissistigma villossimum Merr) Quỳ châu -Nghệ An nghiên cứu thành phần hoá học phân lập 15 hợp chất - Trong số 15 hợp chất phân lập từ Lãnh công lông mượt có hợp chất có tên là: 1-oxo-4α,7α,11-eudesmanetriol; 1β,4α,7α,11-eudesmanetetraol 4-O-(1,3-dihydroxyprop 2-yl)-2-metyl1,2,3,4- tetrahydroxybutan - Đã thử hoạt tính sinh học dịch chiết số chất cho thấy hợp chất N-nornuciferine chất goniothalamin có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào KB Bố cục luận án Luận án gồm 138 trang có bảng, 77 hình, sơ đồ Luận án bao gồm phần sau: Đặt vấn đề (4 trang) Chương 1: Tổng quan (24 trang) Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (4 trang) Chương 3: Thực nghiệm (31 trang) Chương 4: Kết thảo luận (57 trang) Kết luận: (2 trang) Danh mục cơng trình liên quan luận án (1trang) Tài liệu tham khảo, sử dụng 108 tài liệu liên quan (14 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phần thứ Trình bày thực vật họ Na, chi Giác đế chi Lãnh công, Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre), Lãnh công lông mượt (Fissistigma villosissimum Merr) ứng dụng chúng Y học Cây Giác đế miên Cây Lãnh cơng lơng mượt 1.2 Phần thứ hai Trình bày nghiên cứu hoá thực vật chi Giác đế chi Lãnh công CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phần thứ nhất: Trình bày phương pháp phân lập hợp chất từ đối tượng nghiên cứu 2.2 Phần thứ hai: Trình bày phương pháp xách định công thức phân tử chất phương pháp phổ khác như: Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR), Khối phổ va chạm (EI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, hai chiều, Khối phổ phân giải cao (HRMS) phương pháp thử hoạt tính sinh học chất phân lập Phép thử gây độc tế bào tiến hành dòng ung thư biểu mơ KB Hoạt tính chống sốt rét thử với dòng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Phần thứ nhất: Quy trình tách cao tách chất Mẫu Giác đế miên xử lý theo sơ đồ sau: Mau (10 kg) Etylaxetat/4% dd NH3 (3x50l) 2,5 l (GDM) l HCl 5% Etylaxetat (3x5l) Cao EtOAc KH: GDM1 DD H2O Na2CO3 10% Etylaxetat (3x5l) (GDM1; 54 g) Cao EtOAc KH: GDM2 DD H2O CH2Cl2(3x5l) Cao CH2Cl2 KH: GDM3 (GDM2; 43 g) (GDM3; 4,3 g) Sơ đồ 3.1: Chiết tách Giác đế miên dung môi GDM3 (4,3 g) CC 100% CH2Cl2 -> 100% MeOH + 4% dd NH3 F1 (0,1 g) F2 (0,23 g) F3 (0,33 g) F5 F6 F7 F4 (0,51 g) (0,53 g) (0,342 g) (0,32 g) F9 F8 (1,02 g) (0,22 g) sephadex sephadex F7.1 F7.2 F7.3 F7.4 F7.5 F7.6 F7.7 F7.8 F7.9 F7.10 (16 mg)(10 mg) (54 mg)(20 mg) (67 mg) (6 mg) (12 mg) (8 mg) (13 mg) (19 mg) BM GT5 GT4 (4,5 mg) (4,2 mg) BM GT12 (6,2 mg) CC GT1 (4,5 mg) F8.1 F8.4 F8.5 F8.2 F8.3 (210 mg)(150 mg) (17 mg) (200 mg) (350 mg) BM GT7 (10 mg) CC GT13 (7 mg) Sơ đồ 3.2: Phân lập cặn GDM3 Giác đế miên GDM2 (43 g) 100% CH2Cl2 -> 100% MeOH + 4% dd NH3 F8 F1 F5 F6 F7 F3 F4 F2 F9 F10 F11 (13,25 g)(3,08 g) (1,05 g) (3,1 g) (1,07 g) (1,02 g) (1,14 g) (0,39 g) (1,02 g) (9,02 g) (1,15 g) kt CC CC kt GT15 GT18 GT16 (25 mg) (11 mg) (3 g) GT20 (8,1 mg) CC F6.1 F6.2 F6.3 F6.4 F6.5 F6.6 F6.7 F6.8 (0,02 g) (0,17 g) (0,04 g) (0,09 g) (0,375 g) (0,02 g) (0,15 g) (0,25 g) kt CC GT17 (4,2 mg) sephadex CC CC F11.1 F11.2 F11.3 F11.4 F11.5 (345 mg)(475 mg) (923 mg)(830 mg) (275 mg) GT6 GT14 GT10 (6,2 mg) (4 mg) (5,7 mg) CC F7.1 F7.2 F7.3 F7.4 F7.5 F7.6 F7.7 F7.8 (0,01 g)(0,045 g)(0,05 g) (0,08 g) (0,275 g) (0,2 g) (0,15 g) (0,35 g) F11.3.1 F11.3.2 F11.3.3 F11.3.4 (250 mg) (47 mg) (273 mg) (330 mg) sephadex GT2 (4 mg) sephadex GT8 (5.6 mg) F9.1 F9.2 F9.3 F9.4 F9.5 F9.6 F9.7 F9.8 F9.9 F9.10 F9.11 (0,15 g) (0,1g) (0,12 g) (0,3 g) (0,5 g) (0,1 g) (0,15 g) (0,832 g) (0,22 g) (0,5 g) (0,2 g) sephadex F9.8.1 F9.8.2 F9.8.3 F9.8.4 F9.8.5 F9.8.6 F9.8.7 F9.8.8 F9.8.9 F9.8.10 (60 mg) (40 mg) (89 mg) (35 mg) (67 mg) (78 mg) (56 mg) (83 mg) (35 mg) (70 mg) CC sephadex GT11 (6 mg) sephadex GT9 (6 mg) Sơ đồ 3.3: Phân lập cặn GDM2 Giác đế miên GDM1 (54 g) 100% n-hexan ->100% EtOAc 100% EtOAc -> 100% MeOH F1 (25 g) F2 (5,4 g) CC F4 (2,3 g) F3 (1,52 g) CC F4.2 (67 mg) F7 (1,8 g) sephadex CC GT26 GT24 GT27 (9,5 mg) (5 mg) (3 mg) sephadex CC GT19 GT25 GT23 (18 mg) (4 mg) (11 mg) CC GT3 (6 mg) GT28 (3 mg) Sơ đồ 3.4: phân lập cặn GDM1 Giác đế miên Mẫu Lãnh công lông mượt xử lý theo sơ đồ sau: MAU (150g) (l) CH2Cl2 Cao CH2Cl2 Mau1 (l) MeOH FV (10,5 g) CC F4.4 F5.5 F5.1 F5.2 F5.3 F5.4 (43 mg) (87 mg) (240 mg) (20 mg) (98 mg) (260 mg) F4.3 (806 mg) CC F6 (1,63 g) CC sephadex GT29 GT21 GT22 (1,3 mg) (5,1 mg) (3,3 mg) F4.1 (25 mg) F5 (0,783 g) Cao MeOH MFV (4,6 g) Sơ đồ 3.5 Chiết Lãnh công lông mượt dung môi (FV; 10,5 g) CC 100% n-hexan -> 100% EtOAC F1 F4 F3 F5 F6 F2 F7 F8 F10 F11 F9 F12 (0,229 g) (0,069 g) (0,043 g) (0,1g) (0,019 g) (0,49 g) (1,15 g) (0,94 g) (1,94 g) (0,75g) (1,53 g) (0,967 g) CC sephadex CC CC F6.1 F6.3 F6.4 F6.2 (89 mg) (170 mg) (30 mg) (90 mg) FV4 (5,7 mg) CC F10.1 F10.2 F10.3 F10.4 F10.5 (90 mg)(87 mg) (75 mg)(85 mg)(167 mg) FV7 (4,5 mg) sephadex FV8 (2,5 mg) F8.8 F8.1 F8.7 F8.4 F8.5 F8.2 F8.3 F8.6 (98 mg) (76 mg) (68 mg) (94 mg) (75 mg) (90 mg) (80 mg) (87 mg) sephadex CC FV5 FV6 (9,2 mg) (10,8 mg) FV9 (8,5 mg) Sơ đồ 3.6 Phân lập cặn CH2Cl2 Lãnh công lông mượt (MFV;4,6 g) CC 100% CH2Cl2 -> 100% MeOH F1 F4 F5 F2 F3 F6 F7 F8 F9 F10 F11 (0,8 g) (0,1 g) (0,86 g) (0,17 g) (0,41 g) (0,11 g) (0,12 g) (0,46 g) (0,38 g) (0,1 g) (0,12 g) sephadex CC FV12 (3,3 mg) FV1 FV11 (5,6 mg) (7,6 mg) CC CC FV14 FV10 (15 mg) (14 mg) sephadex sephadex FV13 (8,2 mg) F5.1 F5.4 F5.2 F5.3 (95 mg) (73 mg) (87 mg) (96 mg) CC FV15 (20 mg) CC FV2 FV3 (13 mg) ( 15 mg) Sơ đồ 3.7 Phân lập cặn MeOH Lãnh công lông mượt 3.2 Phần thứ hai: Nêu số liệu phổ chất tách 10 CH2-5 thông qua nguyên tử nitơ tạo thành vịng B Tương tự, nhóm CH-7 có độ chuyển dịch hóa học đặc trưng nhóm metin gắn kết với nguyên tử oxy xác định liên kết với vòng D nhờ xuất tương tác H-7 (H 4,42) C-7a (C 133,7) phổ HMBC Mặt khác, hai nhóm metoxy cộng hưởng H (3,70 3,93) xác định liên kết tương ứng với C-1 C-2 vịng A thơng qua tương tác chúng phổ HMBC tương tác nhóm metoxy H 3,93 với H-3 (H 6,95) phổ NOESY Đồng thời, tương tác HMBC C-10 (C 150,9) với nhóm metoxy H 3,91 cho thấy nhóm metoxy liên kết với vịng D vị trí C-10 Điều khẳng định nhờ xuất tương tác không gian H-9 (H 7,08) nhóm metoxy H 3,91 Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR đối chiếu với công thức phân tử cho phép xác định công thức phẳng hợp chất GT1 Cấu hình tương đối hợp chất GT1 xác định nhờ phân tích số tương tác proton phổ NOESY Trên phổ 1H-NMR, proton H-7 xuất dạng doublet với số tương tác anti J = 11,5 Hz, cho thấy mối tương quan trans-diaxial H-7 H-6a Một số tài liệu công bố hợp chất aporphines có nhóm hydroxyl vị trí C-7, phù hợp với chất GT1 Ngồi ra, phổ NOESY thấy tương tác H-6a với Hax5, điều cho thấy H-6a chiếm vị trí axial hai vịng B C Cấu hình tuyệt đối hợp chất GT1 xác định phương pháp Mosher Áp dụng theo mơ hình cơng bố cho phép xác định cấu hình R cho cacbon bất đối C-6a Dựa vào cấu hình tương đối xác định đây, cấu hình S gắn cho C-7 Như hợp chất GT1 β,11-dihydroxy1,2,10-trimetoxy-noraporphin Đây hợp chất ancaloit đặt tên gonitamine 11 MeO 3a A B MeO HO 6a C 11a 11 D MeO NH 1b 1a 7a OH 10 Hình 4.1 Cấu trúc hợp chất GT1 Hợp chất GT2: thu dạng tinh thể hình kim, màu nâu, điểm nóng chảy 215-216 oC có độ quay cực []D28 +0,91 (c, 0,22, CHCl3) Phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm chức cacbonyl max 1655 cm-1 Phổ khối negative HR-ESI-MS cho pic ion phân tử proton hoá m/z 250,10789 [M-H]-, cho phép xác định công thức phân tử C13H17NO4 cho hợp chất GT2 Trên phổ 1H-NMR vùng trường thấp, có xuất tín hiệu năm proton vịng thơm H 7,26 (H-4), 7,34 (H-3 + H-5) 7,46 (H2 + H-6) Ngồi ra, tín hiệu hai proton olefin H 6,42 (H-6’) 6,74 (H-7’) dạng doublet ghi nhận Mặt khác vùng aliphatic, tín hiệu năm proton quan sát thấy Phổ 13 C-NMR DEPT chất GT2 cho tín hiệu 13 nguyên tử cacbon, có cacbonyl (C 177,6, C-1’), nhóm metylen (C 37,2, C-2’), cacbon sp2 bậc (C 138,0, C-1), nhóm metin vịng thơm, ngun tử cacbon olefin nhóm metin sp3 Phân tích phổ COSY hợp chất GT2 cho thấy có mặt nhóm phenyl xác định nhờ chuỗi tương tác proton H-2 + H-6 (H 7,46), H-3 + H-5 (H 7,34) H-4 (H 7,26) Đồng thời chuỗi tương tác xuất phát từ CH2-2’ (H 2,56 2,63) đến H-7’ (H 6,74), thông qua proton H-3’ (H 3,66), H-4’ (H 3,73), H-5’ (H 4,44) H-6’ (H 6,42) ghi nhận Phổ HMBC cho thấy tương tác H-7’ với C-2 (C 127,6) C-6 (C 127,6), H-6’ với C-1 (C 138,0) Điều cho thấy nhóm phenyl liên kết với C-7’ Hơn nữa, tương tác 12 HMBC nhóm cacbonyl C-1’ (C 177,6) với proton H-3’ (H 7,46) cho phép xác định nhóm cacboxylic vị trí cuối mạch Độ chuyển dịch hóa học CH-4’ CH-5’ cho thấy chúng liên kết với nguyên tử oxy độ chuyển dịch hóa nhóm CH-3’ đặc trưng cho nhóm liên kết với nguyên tử Nitơ Ngoài ra, số tương tác H-6’ H-7’ (J = 16,0 Hz) xác định cấu hình trans C-6’ C-7’ Kết hợp với công thức phân tử thu từ phổ HR-ESI-MS, hợp chất GT2 xác định axit 3-amino-4,5dihydroxy-7-phenyl-6-heptenoic Hợp chất phân lập lần đặt tên axit gonitamic OH 7' 6' 5' 4' 3' OH 2' 1' COOH NH2 Hình 4.2 Cấu trúc hợp chất GT2 Hợp chất GT3: phân lập dạng bột, có màu vàng, điểm nóng chảy 123 oC, có độ quay cực []D20 +105,4 (c, 0,5, CHCl3) Phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm chức cacbonyl νmax 1746, 1630 cm-1 Phổ khối HR-ESI-MS cho pic ion phân tử proton hoá m/z 197,06021 [M+H]+, tương ứng với công thức phân tử C13H10O2 Từ công thức phân tử này, bảy nối đôi tương đương xác định cho hợp chất GT3 Tại vùng trường thấp phổ 1H-NMR, tín hiệu mười proton quan sát thấy, có proton vòng thơm H 7,32 (t, J = 7,5 Hz, H-4’), 7,49 (d, J = 7,5 Hz, H-2’ + H-6’), 7,36 (t, J = 7,5 Hz, H-3’ + H-5’) proton olefinic H 6,00 (d, J = 11,5 Hz, H-6), 6,19 (d, J = 5,5 Hz, H-3), 6,82 (d, J = 16,0 Hz, H-8), 7,30 dd (J = 11,5 16,0 Hz, H-7), 7,41 (d, J = 5,5 Hz, H-4) Phổ 13CNMR DEPT chất GT3 cho tín hiệu 13 ngun tử cacbon, có cacbonyl (C 169,5, C-2), cacbon sp2 bậc 10 nhóm metin sp2 Trên phổ COSY, có mặt chuỗi tương tác xác định bao gồm: H- 13 3-H-4, H-6-H-7-H-8 H2’ + H-6’-H-3’ + H-5’-H4’ Các kiện phân tích cho thấy có mặt nhóm phenyl, ba nối đơi nhóm cacboxylic Phổ HMBC cho thấy tương tác xa H-8 (H 6,82) với C-2’ C-6’ (C 127,2), chứng tỏ nhóm phenyl liên kết với C-8 vị trí C-1’ Đồng thời, cacbon bậc C-5 (C 149,0) cho tương tác với H-7 (H 7,30) Điều cho phép khẳng định liên kết C-5 C-6 Độ chuyển dịch hóa học 13C C-5 cho thấy cacbon liên kết với nguyên tử oxy Mặt khác, H-4 (H 7,41) cho tương tác HMBC với C-6 (C 115,1) cacbon cacboxylic C-2 (C 169,5) Dữ liệu cho thấy C-5 liên kết với C-4 nhóm cacboxylic liên kết với C-3 Đối chiếu với bảy nối đôi tương đương thu cho phép xác định có mặt vịng lacton Cấu hình trans C-7 C-8 xác định từ số tương tác mạnh chúng (J = 16,0 Hz) Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR cho phép xác định hợp chất GT3 3,5-demetoxypiperolide Hợp chất tổng hợp trước lần hợp chất phân lập từ tự nhiên 3' 2' 4' 5' 1' 6' O O Hình 4.3 Cấu trúc hợp chất GT3 4.2 Các hợp chất phân lập từ Lãnh công lông mượt Từ Lãnh công lông mượt phân lập 15 hợp chất Cấu trúc hợp chất phân lập xác định phương pháp phổ trình bày sau: Hợp chất FV1: phân lập dạng chất vơ định hình, tan tốt dung mơi CHCl3 có độ quay cực [α]28D -53,2 (c, 1,0, CHCl3) Trên phổ 1H-NMR cho thấy có mặt nhóm metyl singlet H 1,27 (H-13), 1,25 (CH3-12), 1,31 (CH3-15) 1,08 (CH3-14) Phổ 13C-NMR DEPT cho 14 tín hiệu 15 nguyên tử cacbon có cacbon lai hoá sp2 14 cacbon lai hoá sp3 tương ứng với nhóm metyl, nhóm metylen, nhóm metin cacbon bậc bốn có cacbon nhóm cacbonyl Độ chuyển dịch hóa học cacbon C-4 (C 70,8), C-7 (C 75,4) C-11 (C 75,6), đặc trưng cho nguyên tử cacbon liên kết với oxy Từ quan sát cho phép giả thiết FV1 sesquiterpen Trên phổ 1H-1H COSY cho thấy có mặt chuỗi tương tác: CH2-2 (H 2,42, 2,60) CH2-3 (H 1,89, 2,05), H-5 (H 2,19) CH2-6 (H 1,69, 1,89) tương tác CH2-8 (H 1,59 1,89) với CH2-9 (H 1,68 1,74) Phân tích phổ HMBC cho phép gắn kết mảnh phân tử FV1 Theo đó, cacbon bậc bốn C-7 (C 75,4) cho tương tác HMBC với CH2-6 CH2-8 cho thấy liên kết C-7 với cacbon C-6 C-8 Mặt khác C-10 (C 45,9) tương tác với H-5, CH26 CH2-8 Ngoài ra, proton CH3-14 (H 1,08) cho tương tác với C-5 (C 46,9), C-9 (C 30,9) C-10 Phân tích cho thấy C-10 liên kết trực tiếp với C-5 C-9 hình thành vịng A, đồng thời nhóm metyl CH3-14 liên kết với C-10 Trên phổ HMBC, tương tác C-4 (C 70,8) với H-5, CH2-3 CH3-15 ghi nhận, cho thấy liên kết trực tiếp C-4 với C-3 C-15 Tương tác HMBC nhóm keton C-1 (C 215,2) với proton CH22, CH2-3 CH3-14 cho phép xác định C-1 kết nối với C-2 với C-10 vịng A Các phân tích cho thấy có mặt hệ vịng bicyclic phân tử FV1 Cuối cùng, tương tác HMBC proton nhóm metyl CH3-12 (H 1,25) CH3-13 (H 1,27) với cacbon bậc C-7 C-11 cho phép xác định liên kết C-11 với C-7 vòng A Kết hợp với số khối phân tử, cơng thức phẳng FV1 xác định Cấu hình tương đối FV1 xác định nhờ phân tích số tương tác proton phổ NOESY Proton H-5 xuất dạng doublet phổ 1H-NMR với số tương tác, số tương tác gauche (J = 2,5 Hz) số tương 15 tác anti (J = 12,5 Hz), chứng tỏ H-5 vị trí axial vịng A Trên phổ NOESY CH3-14 H 1,08 cho tương tác với CH3-15 H 1,31 Điều cho thấy CH3-14 CH3-15 vị trí axial vịng B Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR cho phép xác định hợp chất FV1 1-oxo-4α,7α,11eudesmanetriol Đây sesquiterpenoit đặt tên fissistinone HO OH H OH O Hình 4.4 Cấu trúc hợp chất FV1 Hợp chất FV2: phân lập dạng vơ định hình màu trắng Các tín hiệu từ phổ 1D-NMR FV2 cho thấy hợp chất có khung với FV1 Trong đó, điểm khác biệt hợp chất phổ 13C-NMR xuất nhóm hydroxymetin (C 80,2) thay nhóm keton FV1 Phân tích phổ 1H-1H-COSY cho thấy có chuỗi tương tác: CH2-8 (H 1,51 1,81) với CH2-9 (H 1,45 1,73), H-5 (H 1,68) với CH2-6 (H 1,68 1,68) chuỗi tương tác từ H-1 (H 3,30,) đến CH2-3 (H 1,58 1,81) thông qua CH2-2 (H 1,61 1,68) Độ chuyển dịch hóa học CH-1 cho thấy C-1 liên kết với nguyên tử oxy Từ phân tích cho phép sơ kết luận nhóm keton hợp chất FV1 khử nhóm hydroxyl phân tử FV2, khẳng định nhờ phổ HMBC Proton nhóm CH3-14 (H 0,88) cho tương tác HMBC với cacbon C-1 (C 80,2), C-5 (C 47,8), C-9 (C 37,3) C-10 (C 39,9), khẳng định nhóm hydroxyl C-1 nhóm metyl CH3-14 liên kết với C-10 Sự gắn kết CH3-15 với C-4 vòng B khẳng định nhờ tương tác proton CH3-15 (H 1,11) với C-3 (C 42,2), C-4 (C 72,3) C-5 (C 47,8) Đồng thời liên kết nhóm isopropanol với C-7 16 vòng A xác định từ tương tác HMBC proton H 1,21 (CH3-12 CH3-13) với C-11 (C 76,2) C-7 (C 76,9) Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR xác định cấu trúc phẳng FV2 giống với FV1, khác nhóm hydroxyl C-1 thay nhóm keton FV1 Phân tích số tương tác phổ NOESY cho phép xác định cấu hình tương đối FV2 Theo đó, H-1 cho số tương tác, bao gồm số tương tác anti (J = 10 Hz) số tương tác gauche (J = 4,5 Hz) Như vậy, H-1 chiếm giữ vị trí axial Ngồi ra, phổ NOESY cịn có tương tác CH3-15 (H 1,11) với CH3-14 (H 0,88), nhóm metyl chiếm giữ vị trí axial vịng B Cuối cùng, nhóm isopropanol chiếm giữ vị trí equatorial xác định thơng qua tương tác NOESY CH3-12 CH3-13 (H 1,21) với proton nhóm metylen CH2-6 (H 1,68 1,68) CH2-8 (H 1,53, 1,81) Cấu trúc hóa học FV2 xác định 1β,4α,7α,11 eudesmanetetraol Hợp chất sesquiterpenoit đặt tên fissistinol HO OH H OH OH Hình 4.5 Cấu trúc hợp chất FV2 Hợp chất FV3: phân lập dạng dịch dầu màu vàng nhạt, tan tốt dung mơi MeOH có độ quay cực [α]28D +7 (c, 1,0, CHCl3) Trên phổ 1H-NMR có tín hiệu nhóm metyl H 1,14 (s, CH3-5) Ngồi cịn xuất tín hiệu 10 proton cộng hưởng khoảng từ 3,0 đến 4,0 ppm Phổ 13 C-NMR DEPT cho biết tín hiệu nguyên tử cacbon lai hoá sp3 tương ứng với nhóm metyl, nhóm metylen, nhóm metin cacbon bậc bốn Ngoại trừ nhóm metyl, độ chuyển dịch hóa học ngun tử cacbon cịn lại nằm khoảng 63,8 đến 76,2 ppm Từ 17 liệu cho thấy hợp chất FV3 cacbonhydrat Trên phổ COSY cho thấy tương tác H-1’ (H 3,68) với metylen trùng CH22’(H 3,55, 3,61) CH2-3’ (H 3,55, 3,61) Điều cho phép giả thiết có mặt glycerol Ngồi ra, cịn xuất tương tác H-3 (H 3,63) với CH2-4 (H 3,62 3,82) Phân tích phổ HMBC cho thấy cacbon bậc C-2 (C 74,9) cho tương tác với CH2-1 (H 3,47, 3,54), H-3 (H 3,63) CH3-3 (H 1,14) Điều cho thấy, C-2 liên kết với C-1 C-3 Đồng thời, tương tác C-4 (C 63,8) với H-1’ xác định liên kết C-4 C-1’ thông qua nguyên tử oxy Hợp chất FV3 xác định 4-O-(1,3-dihydroxyprop-2yl)-2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroxybutan phân lập lần OH 2' HO O 1' 3' OH HO HO Hình 4.6 Phổ HMBC hợp chất FV3 18 4.3 Công thức hợp chất phân lập H3CO H3CO H H3CO HO H3CO OH NH OH OH NH H3CO O O O NH2 OH NH H3CO HO H3CO H3CO GT2 GT1 H3CO OH N H3CO HO OCH3 H3CO NH NH H3 CO O O O H3 CO H3CO GT5 GT4 GT3 NH O N O N O H3CO OH GT7 GT6 HO GT8 H3CO N H3CO HO H3CO N O O O O O O O O O HO O OH GT13 GT12 O O H3CO OH GT11 O O O N H3CO GT10 GT9 GT16 GT15 GT14 GT17 O OH O OH H3CO 4''' 5''' 3''' OH 6''' 5' HO 8a O 1' O 5a 8'' O CHO 7'' HO 5'' 6'' COOH OH OH O GT19 H3CO GT20 CHO GT24 H3CO HO COOH OH GT26 OCH3 OH OCH3 HO GT25 H3 CO G22 CHO OH OH GT23 3'' 8''a 4'' 5''a 2' O OH O 3' GT21 2'' 1'' 4' 6' H3CO 2''' 1''' GT18 COOH COOH GT27 OCH3 H3 CO 36 HO GT28 GT29 Hình 4.7: Các hợp chất phân lập từ Giác đế miên 19 13 15 OH 12 HO 10 OH OH H 11 OH H HO HO HO 14 FV1 OH O OH FV2 OH H OH OH O H HO OH FV4 OH FV3 H OH H H OHC OHH H OHH OH FV5 OH 14 COOH FV8 FV7 FV6 COOH COOH 10 12 H 15 11 O HO OH OH OCH3 OH FV9 OH OH FV10 13 FV11 FV12 CHO OH OH OH FV13 OH OH HOH2C CH2OH OH FV14 OH CH2OH HOH2C OH OH FV15 Hình 4.8: Các hợp chất phân lập từ Lãnh công lơng mượt 20 4.4 Khảo sát hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập từ Giác đế miên Lãnh công lông mượt Các phân đoạn tách từ dịch chiết tổng số chất phân lập Giác đế miên Lãnh công lông mượt tiến hành thử hoạt tính sinh học Bảng 4.1 Hoạt tính chất phân lập từ Giác đế miên KB (% ức chế) MRC-5 (% ức chế) Kí hiệu mẫu C10 µg.mL1 C1 µg.mL1 C10 µg.mL1 C1 µg.mL1 GT1 GT2 GT3 GT4 40 GT5 GT6 GT7 GT8 GT9 GT10 GT11 GT12 GT13 GT14 GT15 GT16 GT17 GT18 GT19 24 57 GT20 GT21 GT22 GT23 GT24 - 21 Bảng 4.8 Hoạt tính chất từ Lãnh cơng lơng mượt KB (% ức chế) Kí hiệu mẫu C10 µg.mL1 FV1 FV2 FV3 FV4 FV5 FV6 FV7 FV8 FV9 - MRC-5 (% ức chế) C1 µg.mL1 C10 µg.mL1 - C1 µg.mL1 - Từ kết thu nhận thấy số chất có hoạt tính yếu hai phép thử chất GT2, GT12, GT17, GT20, GT21, GT22, FV2, FV9, GT6, GT11, GT14, GT24, FV4, FV6, FV7, FV8 Ngoài số chất có hoạt tính cao chất GT4, GT19 Theo số tài liệu cơng bố số chất tách từ Giác đế miên Lãnh công lông mượt tách từ lồi khác thử hoạt tính sinh học cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học hợp chất ancaloit tách từ Giác đế miên đặc biết hợp chất Goniothalamin có hoạt tính chống sốt rét tốt Hợp chất Goniodiol có hoạt tính nhiều dịng tế bào ung thư khác A549, K562, GLC4 Hợp chất goniothalamin có hoạt tính dịng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư dày HGC-27, ung thư ngực MCF.7, ung thư máu HL-60, ung thư buồng trứng Cao-3 Hợp chất Axit p-metoxycinnamic có hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hoá tốt 22 KẾT LUẬN Trong q trình thực luận án, chúng tơi thu kết sau: Đã nghiên cứu thành phần hoá học Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre) Lãnh công lông mượt (Fissistigma villosissimum Merr) Việt nam Từ Giác đế miên phân lập 29 hợp chất, bao gồm mười hai ancaloit là: 7β, 11- dihydroxy - 1, 2, 10 -trimetoxy - noraporphin; N - nornuciferine; norisocorydine; isocorydine; - hydroxynornuceferine; o -metylisopiline; annonaine; roemerine; roemeroline; boldine; glaunine; liriodenine, hợp chất amino axit là: axit - amino - 4, dihydroxy -7 - phenyl - - heptenoic sáu hợp chất styryllactone là: 3, - demetoxypiperolide; - deoxygoniopypyrone; - epi - - deoxy goniopypyrone; - epi - - deoxygoniopypyrone acetate; goniodiol; goniothalamin 10 hợp chất khác là: amentoflavone; axit cinnamic; axit p - metoxycinnamic; axit 3, - dimetoxycinnamic; syringaldehyde; vanilline; - hydroxybenzaldehyde; axit protocatechuic; 2, 4, trimetoxyphenol; - hexatriacontanol Trong số 29 hợp chất phân lập có ancaloit hợp chất có tên 7β,11-dihydroxy-1,2,10-trimetoxy-noraporphin, amino axit là: axit 3-amino-4,5-dihydroxy-7-phenyl-6-heptenoic chất lần đầu phân lập tự nhiên 3,5-demetoxypiperolide Từ Lãnh công lông mượt (Fissistigma villosissimum Merr) phân lập 15 hợp chất là: 1-oxo-4α,7α,11-eudesmanetriol; 1β,4α,7α,11-eudesmanetetraol; - O - (1,3 - dihydroxyprop - - yl) - 23 - metyl - 1,2,3,4 - tetrahydroxybutan; 4(15) - eudesmene-1β-7-11-triol; 1,6-dihydroxy-4(15)-eudesmene; 10-hydroxycadin-4-en-15-al; spathulenol; alloromadendran 4-10-diol; 10β-hydroxy-6-isodaudau3-en-15-al; axit shikimic; axit 3,4-dihydroxybenzoic; axit vanillic; 3,4dihydroxybenzaldehyde; arabinitol; hexitol Trong số 15 hợp chất phân lập có hợp chất có tên 1-oxo4α,7α,11-eudesmanetriol; 1β,4α,7α,11-eudesmanetetraol; 4-O-(1,3- dihydroxyprop-2-yl)-2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroxybutan Đã thử hoạt tính sinh học dịch chiết số chất cho thấy hợp chất N-nornuciferine, goniothalamin có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào KB 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN LUẬN ÁN Trần Đăng Thạch, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Trần Văn Hiệu, Marc Litaudon, Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Hùng, Châu Văn Minh, “Thành phần hoá học Goniothalamus tamirensis Pierre ex Fin.& Gagn Họ Na (Annonaceae)’’, Tạp chí Hố học, T.47 (4A), Tr 432-436, 2009 Trần Đăng Thạch, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Trần Văn Hiệu, Marc Litaudon, Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Hùng, Châu Văn Minh, “Nghiên cứu phân lập ancaloit từ Goniothalamus tamirensis Pierre.”, Tạp chí Hố học, T.48 (4B), Tr 423-428, 2010 Trần Đăng Thạch, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Trần Văn Hiệu, Marc Litaudon, Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Hùng, Châu Văn Minh, “Thành phần hoá học Giác đế Tamir họ Na (Annonaceae)’’, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, T.48 (6A), Tr1-12, 2010 Trần Đăng Thạch, Trần Hữu Giáp, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Minh Hằng, Marc Litaudon, Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Hùng, Châu Văn Minh, “Thành phần hố học Lãnh cơng lơng mượt họ Na (Annonaceae)’’, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, T.48 (4A), Tr58-63, 2010 Trần Đăng Thạch, Nguyễn Văn Hùng, Lê Văn Hạc, Hồ Quốc Việt, Tống Thị Mai Nhung, Nguyễn Mạnh Tuấn, “Tách xác định cấu trúc số hợp chất từ Bù tru (Uvaria grandiflora Roxb &Hornem) Hà Tĩnh’’, Tạp chí Hố học & Ứng dụng, Số 1, Tr.41-44, 2010 Trần Đăng Thạch, Cao Đức Danh, Đồn Chí Hiếu, Phạm Văn Cường, Đồn Thị Mai Hương, Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Hùng, “Thành phần hoá học Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre ex Fin & Gagn), họ Na (Annonaceae)’’, Tạp chí Hoá học & Ứng dụng, Số 3(7), Tr.58-63, 2011 Trần Đăng Thạch, Nguyễn Quốc Võ, Nguyễn Văn Hiến, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Hùng, “Tách xác định cấu trúc số hợp chất từ Phát lãnh công (Fissistigma petelotii Merr) Hồ Bình’’, Tạp chí Hố học & Ứng dụng, Số 3(7), Tr.41-44, 2011 Dang Thach Tran, Huong Doan Thi Mai, Van Cuong Pham, Marc Litaudon, Francoise Guéritte, Van Hac Le, Van Hung Nguyen and Van Minh Chau “Alkaloids and Other Constituents from the Leaves of Goniothalamus tamirensis’’, Planta med 2011 (submitted) Dang Thach Tran, Van C uong Pham, Huong Doan Thi Mai, Marc Litaudon, Francoise Guéritte, Van Hac Le, Van Hung Nguyen and Van Minh Chau “Sesquiterpenoids from fruits of Fissistigma villosissimum” Phytochemistry Lett 2011 (submitted) ... hoạt tính chống sốt rét ký sinh trùng Plasmodium facilparum (ức chế 58,3 % nồng độ g/ml) Vì chúng tơi chọn đề tài: '' ''Nghiên cứu thành phần hoá học số thuộc họ Na (Annonaceae) khảo sát hoạt tính. .. hợp chất GT1 β ,11 -dihydroxy1,2 ,10 -trimetoxy-noraporphin Đây hợp chất ancaloit đặt tên gonitamine 11 MeO 3a A B MeO HO 6a C 11 a 11 D MeO NH 1b 1a 7a OH 10 Hình 4 .1 Cấu trúc hợp chất GT1 Hợp chất. .. phổ phân giải cao (HRMS) phương pháp thử hoạt tính sinh học chất phân lập Phép thử gây độc tế bào tiến hành dịng ung thư biểu mơ KB Hoạt tính chống sốt rét thử với dòng ký sinh trùng sốt rét