NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPD- PCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE Nguyễn Hoài Giang Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu, nấm linh chi (Ganoderma) được biết tới như một loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và chữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, dị ứng ). Ganoderma có khả năng tăng cường sự thải độc ở gan và kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động hiệu quả hơn. Ganoderma còn kìm hãm sự sinh tổng hợp ADN mới của tế bào ung thư, kìm hãm sự phát triển của các khối u và hạn chế sự di căn. Các nghiên cứu y và dược học cũng cho thấy các loài Ganoderma khác nhau cũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt tính khác nhau (1). Việc phân loại Ganoderma dựa vào hình thái và các isozym gặp nhiều khó khăn, nhiều khi thiếu chính xác. Gần đây, việc sử dụng đoạn trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) của ADN ribosom và kỹ thuật nhân bản ngẫu nhiên ADN bằng mồi tuỳ ý (Random Amplified Polymorphic DNA: RAPD) đã góp phần quan trong trọng việc phân loại Ganoderma ở mức độ ADN (2). Ngoài tác dụng làm thuốc, Ganoderma cũng là những loài nấm gây bệnh và phá huỷ nhiều cây thân gỗ. Laccase, lignin peroxidases (LIPs) và peroxidases phụ thuộc mangan (MNPs) là ba nhóm enzym được cho là có vai trò quan trọng trong việc phân huỷ gỗ của các loại nấm. Enzym laccase, LIPs và MNPs có khả năng oxy hoá các phức phenolic để tạo thành gốc phenoxy. Mỗi phân tử enzym laccase liên kết với bốn nguyên tử đồng. Những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của laccase cho thấy tại vị trí giữa một axit amin cystein và mười axit amin histidin là điểm bám cho bốn nguyên tử đồng và trình tự ở quanh vị trí này thường rất ít thay đổi ở những loài nấm khác nhau (3, 4). Nghiên cứu này giới thiệu một cách tiếp cận nhằm góp phần phân loại và xếp nhóm ở Ganoderma: Sử dụng RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPU1 và PCR với cặp mồi đặc hiệu cho hai đoạn trong gen laccase. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Vật liệu: Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma australe sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Ga 1 và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và Gb 2; Ganoderma tortnatum sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma australe được ký hiệu là Gau, do phòng thí nghiệm nấm - Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp. Phương pháp nghiên cứu: - Tách chiết ADN từ các mẫu Ganoderma theo phương pháp của Porebski và được thích ứng với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam theo cải tiến của các tác giả Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương (6). - Kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1, trình tự là 5'- ACGGACGTCA -3' (6). - PCR với mồi đặc hiệu cho 2 đoạn gen laccase của G. lucidum 103561 (4). - Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc (7). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân loại Ganoderma Đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma. Tuy nhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thay đổi ở một số taxon gần nhau. Do vậy nếu chỉ sử dụng kết quả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao trong phân loại Ganoderma (2). Trong thời gian gần đây, kỹ thuật RAPD-PCR được sử dụng rất phổ biến và là một trong những phương pháp nhạy, có hiệu quả cao để phân biệt những taxon không thể phân biệt được bằng ITS (2). Để phân loại các loài Ganoderma mà chúng tôi hiện đang có, kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1 được sử dụng (6). Điều kiện PCR sau khi được tối ưu hoá là 94 o C 2 phút/ 35 chu kỳ với 94 o C 1 phút, 46 o C 30 giây, 72 o C 2 phút/ 72 o C 10 phút. Kết quả điện di trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc cho thấy: các mẫu Ganoderma lucidum có 5 băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 1636, 800, 690, 630 và 450 bp; các mẫu Ganoderma australe sensulato có 4 băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 1824, 407, 370 và 300 bp; các mẫu Ganoderma applanatum sensulato có 3 băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 310, 240 và 140 bp; các mẫu Ganoderma tortnatum sensulato có 4 băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 702, 510, 412 và 350 bp. Mẫu Ganoderma australe có 1 băng ADN kích thước khoảng 450 bp giống như các mẫu Ganoderma lucidum. Kết quả RAPD-PCR với mồi OPU 1 cho thấy các mẫu nấm Ganoderma lucidum, Ganoderma australe sensulato, Ganoderma applanatum sensulato, Ganoderma tortnatum sensulato và Ganoderma australe có những băng ADN đặc trưng riêng của từng loài. Hơn nữa, ở các mẫu dưới loài ngoài những băng khác nhau, giữa chúng còn có những băng đặc trưng riêng biệt. Hình 1. Kỹ thuật RAPD-PCR với các mẫu Ganoderma khác nhau Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2). Giếng 3: Ganoderma australe (Gau). Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2). Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và Gb 2). Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga 2). Mr: Thang ADN chuẩn 1kb Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho 2 đoạn của gen laccase trong phân loại Ganoderma Những nghiên cứu về gen laccase cho thấy vùng I và II ở vị trí bám của nguyên tử đồng thường có trình tự không thay đổi (4). Vùng bảo thủ này tại đầu N của enzym laccase có trình tự là HWHGFQ và TFWYHSH. Căn cứ vào các axit amin này chúng tôi đã thiết một cặp mồi đặc hiệu cho gen này ở Ganoderma lucidum 103561 là LA1: 5'- CAT TGG CAC GGA TTC TTC -3’; LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3'. Điều kiện PCR sau khi tối ưu hoá là 94 o C 3 phút/ 30 chu kỳ với 94 o C 30 giây, 55 o C 30 giây, 72 o C 20 giây/ 72 o C 3 phút. Kết quả điện di các sản phẩm PCR cho thấy: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2) tạo ra 2 băng ADN với kích thước 217 và 144 bp. Ganoderma australe (Gau) tạo ra 1 băng kích thước 144 bp. Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2) tạo ra 1 băng kích thước 144 bp. Ganoderma australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato (Ga và Gb) không cho sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn trong gen laccase của Ganoderma lucidum 103561 (Hình 2). Kết quả với mồi ngẫu nhiên OPU 1 (từ giếng 6 đến 9, hình 1) đã khẳng định tất cả các mẫu Ganoderma đã được tách chiết tốt. Việc không tạo ra PCR sản phẩm của Ganoderma australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato chỉ có thể là do trình tự gen laccase (nếu có) của chúng khác với trình tự của Ganoderma lucidum 103561 tại vị trí được chúng tôi thiết kế cặp mồi. Kết quả này phù hợp với kết quả tách dòng gen laccase từ nhiều loài nấm khác nhau của D’souza và các cộng sự (1996). Sử dụng cặp mồi thoái hoá (degenerate PCR primers) được thiết kế tại vùng bảo thủ của gen laccase, D’souza và các cộng sự quan sát được 2 băng sản phẩm PCR kích thước 217 và 144 bp ở các loài nấm Ganoderma lucidum 103561, Grifola frondosa, Lentinula edodes và Lentinus tigrinus. Ở các loài nấm Ganoderma lucidum 58537, Phlebia brevispora, Phlebia tremellosa và Trametes versicolor sản phẩm PCR với cặp mồi kể trên chỉ là một băng với kích thước 217 bp. Trong thí nghiệm sử dụng cặp mồi laccase do chúng tôi thiết kế cũng cho 1 băng duy nhất kích thước 217 bp với Ganoderma lucidum của Hàn quốc (kết quả chưa công bố). Ở loài Gloeophyllum trabeum sản phẩm PCR của gen laccase lại chỉ là một băng duy nhất với kích thước 144 bp. Ngược lại ở các loài nấm Fomes fomentarius và Pleurotus ostreatus thì không quan sát được sản phẩm PCR. Kết quả nghiên cứu này cũng gợi ý chúng tôi việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen laccase ở Ganoderma lucidum 103561 để thực hiện phân loại Ganoderma. Về cơ bản nếu 1 mẫu nấm cho 2 băng ADN sản phẩm PCR (217 và 144 bp) với cặp mồi đặc hiệu cho gen laccase của Ganoderma lucidum 103561 thì chúng có nhiều khả năng sẽ thuộc nhóm Ganoderma lucidum. Nếu mẫu nấm cho 1 băng ADN sản phẩm PCR (144 bp) thì [...]... mẫu Ganoderma khác nhau bằng PCR Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2) Giếng 3: Ganoderma australe (Gau) Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2) Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và Gb 2) Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga 2) Mr: Thang ADN chuẩn 1kb KẾT LUẬN Kỹ thuật RAPD-PCR có thể sử dụng để xác định mối quan hệ về nguồn gốc các loài Ganoderma. ..mẫu này có nhiều khả năng thuộc nhóm Ganoderma australe hoặc Ganoderma tortnatum sensulato Ngược lại nếu không tạo ra được sản phẩm PCR thì mẫu đó ít có khả năng là Ganoderma lucidum, Ganoderma australe hoặc Ganoderma tortnatum sensulato Nhóm Ganoderma australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato có thể vẫn có gen mã hoá cho enzym laccase nhưng trình tự sẽ khác với cặp mồi chúng tôi đã thiết... phẩm PCR khi được nhân lên với cặp mồi đặc hiệu của Ganoderma lucidum 103561 Bước tiếp theo của nghiên cứu này sẽ là tiến hành giải trình tự các đoạn gen laccase của các loài Ganoderma ở Việt nam, để nghiên cứu sự giống và khác nhau của các loài Ganoderma lucidum Sau khi biết trình tự của các đoạn trong gen laccase này chúng tôi có thể sẽ sử dụng kỹ thuật RFLP để phân biệt các loài khác nhau cho cùng... Việt nam Gen laccase là một chỉ thị phân tử có triển vọng để ứng dụng trong việc phân loại và định nhóm Ganoderma ở Việt nam LỜI CẢM ƠN Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ của Chương trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học Tự nhiên, hướng 8.2 This work was supported by the National Basis Research Program for Natural Sciences, direction 8.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Jong, S C., and Birmingham,... 8-15 6 Nguyễn Thị Kim Dung, Lê Đình Lương (2004) Nghiên cứu khắc phục khó khăn trong tách chi t ADN và bất hoạt ức chế PCR ở Ganoderma Tạp chí Di truyền học và ng dụng Số 4, trang 1-7 7 Sambrook, J., Frisch, E F., and Maniatis, T (1989) Molecular Cloning SUMMARY Classification of the Ganoderma complex by RAPD- PCR and specific primers of laccase gene Ganoderma species are known as the herb of longevity... OPU1 primer (5'- ACGGACGTCA -3') and PCR with the specific pair of PCR primers for laccase gene from Ganoderma lucidum 103561 (LA1: 5'- CAT TGG CAC GGA TTC TTC -3’ and LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3') can be used for classification of Ganoderma complex in Vietnam Người thẩm định nội dung khoa học: GS.VS Vũ Tuyên Hoàng ... individual strains Parsimony analysis of nucleotide sequences from the internal transcribed spacers (ITS) of the ribosomal gene can be used to distinguish some monophyletic groups of the Ganoderma species However, some other Ganoderma species have identical ITS sequences RAPD-PCR is one of the most sensitive and efficient methods currently available for distinguishing between different strains of a species... Natural Sciences, direction 8.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Jong, S C., and Birmingham, M J (1992) Medical benefits of the mushroom Ganoderma Advance and Applied Microbiology 37, pp 101-134 2 Hseu R., Wang H H., Wang F H., and Moncalvo M J (1996) Differentiation and grouping of isolates of the Ganoderma lucidum complex by random amplified polymorphic DNA- PCR compared with grouping on the basis of internal transcribed . NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPD- PCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE Nguyễn Hoài Giang Viện Vệ sinh Dịch tễ. 6% và nhuộm bạc (7). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân loại Ganoderma Đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma. . tiếp cận nhằm góp phần phân loại và xếp nhóm ở Ganoderma: Sử dụng RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPU1 và PCR với cặp mồi đặc hiệu cho hai đoạn trong gen laccase. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Vật