XENORHABDUS SP. CA: MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEINAZ NGOẠI BÀO TỪ VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thuỳ Dương Khoa Sinh học, Ttường Đại học Khoa học Tự nhiên Phan Thị Hà Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Ở Việt Nam, một số chủng tuyến trùng gây bệnh côn trùng đã được phân lập từ đất thuộc một số địa phương trong cả nước [4]. Các chủng tuyến trùng này đã được nghiên cứu và thử nghiệm trong phòng trừ sinh học có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn [3,5]. Khả năng gây bệnh của các chủng tuyến trùng có liên quan đến các vi khuẩn cộng sinh với chúng [1]. Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng ứng dụng trong phòng trừ sinh học không thể không quan tâm tìm hiểu các vi khuẩn cộng sinh với chúng. Trong bài viết trước [14] chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu một số tính chất của proteinaz được tiết ra từ vi khuẩn Xenorhabdus sp. XS4 được phân lập từ tuyến trùng Steinernema ở Việt Nam. Các proteinaz này được phân loại thuộc nhóm proteinaz kim loại do bị ức chế mạnh bởi EDTA và o-phenalthroline. Nhằm tiếp tục tìm hiểu tính chất của proteinaz do vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng tiết ra, trong bài viết này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu về proteinaz được tiết ra từ vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA, một chủng vi khuẩn được phân lập từ tuyến trùng Steinernema carpocapsae. I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA được phân lập từ tuyến trùng Steinernema carpocapsae do Phòng Tuyến trùng, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Nghĩa Đô- Từ Liêm, Hà Nội cung cấp. Phân lập và nuôi cấy theo phương pháp đã được mô tả như trước [14]. Xác định hoạt độ của proteinaz: hoạt độ proteinaz đã được xác định theo phương pháp Kunitz có cải tiến như đã mô tả trước đây [13]. Định lượng protein theo phương pháp Lowry sử dụng albumin huyết thanh bò làm chuẩn. Điện di protein trên gel polyacylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli (1970) [8]. Điện di proteinaz theo phương pháp của Heussen và Dowdle (1980) [7] được thực hiện như đã mô tả từ trước [13]. Chuẩn bị mẫu như sau: mẫu được ủ với EDTA hoặc PMSF trong 10 phút với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10 -3 M, sau đó bổ sung ion Mn 2+ hoặc Fe 2+ với nồng độ cuối cùng bằng 5. 10 -3 M và 10 -2 M. II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. pH thích hợp của proteinaz pH thích hợp của enzym được xác định với cơ chất được hoà tan trong các đệm có nồng độ 0,2M. Kết quả cho thấy enzym hoạt động mạnh ở pH 8 (hình1), tương tự như các nghiên cứu khác về proteinaz của vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng [12,13,15]. Chữ viết tắt: DMSO: Dimethyl Sulfoxide, PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride, pCMB: p- chloromercuribenzoate, EDTA: ethylendiaminetetraacetic acid, o-phe: 1,10 – o-Phenanthroline. Hình 1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ proteinaz của vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Xenorhabdus sp. CA 2. Ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu nhóm đến hoạt độ enzym Trong số 4 chất ức chế đặc hiệu nhóm được thử nghiệm (PMSF, pCMB, EDTA, o-phenalthroline), enzym bị ức chế mạnh nhất bởi PMSF và EDTA (ức chế trên 90%), còn o- phenalthroline chỉ ức chế một phần hoạt độ enzym (ức chế gần 10%) (hình 2). Hình 2: Ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu nhóm đến hoạt độ proteinaz của vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA 3. Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị hai đến hoạt độ enzym Các ion kim loại được sử dụng gồm: Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ , Co 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3 M. Kết quả cho thấy enzym bị giảm hoạt tính mạnh nhất bởi Hg2+, sau đó đến Zn 2+ , Co 2+ và Cu 2+ ; ngược lại, ion Ca 2+ và Mg 2+ đã làm tăng hoạt độ enzym 10-15% (hình 3) Hình 3: Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị hai đến hoạt độ proteinaz của vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA 4. Độ bền với nhiệt ở 60 O C Giữ dung dịch enzym ở 60 O C, sau những khoảng thời gian nhất định làm lạnh nhanh chúng và xác định hoạt độ proteinaz ở 37 0 C. Kết quả cho thấy hoạt độ enzym giảm dần theo thời gian xử lý ở 60 0 C. Sau 10 phút, hoạt độ còn khoảng 15% so với hoạt độ ban đầu (hình 4). Hình 4: Sự biến đổi hoạt độ proteinaz theo thời gian xử lý ở 600C 5. Phân tích thành phần proteinaz bằng điện di Điện di trên gel polyacrylamit có SDS và có cơ chất gelatin 0,1% đã cho thấy có nhiều băng proteinaz (hình 5). Trong số các băng proteinaz được nhìn thấy trên bản gel, băng proteinaz có độ di động điện di 0,151 (biến đổi từ 0,127 đến 0,175) thể hiện hoạt độ mạnh nhất. Đây cũng chính là băng proteinaz bị ức chế bởi EDTA và PMSF. Băng proteinaz có độ di động điện di 0,310, không bị ức chế bởi EDTA nhưng bị ức chế bởi PMSF. Băng proteinaz 0,246 bị ức chế hoàn toàn bởi PMSF, nhưng cũng bị ức chế một phần bởi EDTA. Hình 5: Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các proteinaz của Xenorhabdus sp. CA (ghi chú: giếng 2-5, ức chế bởi EDTA; giếng 7-10, ức chế bởi PMSF; 1, đối chứng-H20; 2, đối chứng-EDTA; 3 và 8, Mn2+ 5.10-3M; 4 và 9, Fe2+ 5.10-3M; 5 và 10, Fe2+ 10- 2M; 6, đối chứng-DMSO; 7, đối chứng-PMSF) Như vậy, kết quả nghiên cứu đã cho thấy: hoạt độ proteinaz trong dịch nuôi cấy vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA mạnh nhất ở pH 8. Enzym kém bền với nhiệt, hoạt độ giảm nhanh sau 10 phút xử lý enzym ở 60 0 C. Các chất ức chế đặc hiệu nhóm như PMSF và EDTA làm giảm mạnh hoạt độ enzym (ức chế trên 90% hoạt độ), đưa đến giả thiết cho rằng vi khuẩn Xenorhabdus sp.CA đã tiết ra môi trường nuôi cấy cả proteinaz thuộc nhóm xêrin và nhóm kim loại theo phân loại của Hartley (1960) [6]. Proteinaz kim loại là enzym được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng như: Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Serratia marcescens [9,10]. Proteinaz kim loại cũng được tìm thấy ở các vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc các chủng Xenorhabdus [11,12,13] và Photorhabdus [10,12,13]. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là: bằng kỹ thuật điện di enzym, chúng tôi đã nhận ra được một băng proteinaz bị ức chế bởi cả EDTA và PMSF. Đây là băng chiếm ưu thế nhất trong bản gel điện di. Câu hỏi được đặt ra là: liệu trong băng này có chứa một loại proteinaz thuộc nhóm proteinaz kim loại nhạy cảm với PMSF (còn gọi là proteinaz-xêrin như đã được tìm thấy ở vi khuẩn Bacillus pumilus [2]), hay băng này gồm một số băng có độ di động điện di giống nhau, trong đó có thành phần proteinaz xêrin nhạy cảm với PMSF và có thành phần proteinaz kim loại nhạy cảm với EDTA. Để trả lời câu hỏi này, cần phải tiếp tục đi sâu nghiên cứu hơn nữa về thành phần proteinaz ngoại bào của Xenorhabdus sp.CA. III. KẾT LUẬN 1. Hoạt độ proteinaz mạnh nhất ở pH 8. Sau khi xử lý ở 60 0 C trong 10 phút, hoạt độ enzym còn khoảng 15% hoạt độ ban đầu. 2. Trong số các ion kim loại hoá trị hai được nghiên cứu, enzym bị ức chế mạnh bởi Hg 2+ , sau đó đến Zn 2+ , Co 2+ và Cu 2+ . Ngược lại, các ion Ca 2+ và Mg 2+ đã làm tăng hoạt độ enzym. 3. Xenorhabdus sp. CA đã tiết ra môi trường nuôi cấy các proteinaz thuộc nhóm xêrin và nhóm kim loại. Điện di trên gel polyacrylamit đã cho phép nhận thấy một băng proteinaz chủ yếu bị ức chế bởi cả EDTA và PMSF. [...]... Nealson K.N., 1988 Appl Environ Microbiol., 54: 2793- 2797 12 Trịnh Hồng Thái, Nguyễn Hoài Hà, Phạm Thị Trân Châu, 1999 Tạp chí sinh học, 21 (1b): 173- 179 13 Trinh Hong Thai, Boigegrain R.A., Brehelin M., 2001 J Genetics and Applications Specical Issue: Biotechnology, p 10- 17 14 Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Phan Thị Hà, 2002 Tóm tắt báo cáo Hội nghị khoa học Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN,... Châu and Henryk Urbanek, 1974 Acta Micobiol Polo 5(23)1:21-25 3 Nguyễn Ngọc Châu, 1998 Tạp chí khoa học và công nghệ, XXXVI (3): 24- 29 4 Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, Lại Phú Hoàng, Phan Kế Long, 1999 Tạp chí Sinh học, 21(2b):9095 5 Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Lại Phú Hoàng, Ngô Xuân Tường, 1999 Tạp chí Sinh học, 21(2b):104-113 6 Hartley B.S., 1960 Ann Rev Biochem., 29 (60): 45- 72 7 Heussen C and... Bacteriol., 175: 1665- 1673 SUMMARY XENORHABDUS SP CA: CHARACTERIZATION OF EXTRACELLULAR PROTEINASES FROM ENTOMOPATHOGENIC BACTERIA Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong, Luong Thuy Duong, Phan Thi Ha Extracellular proteinases secreted by entomopathogenic bacteria have been characterized Their pH optimum was 8 The proteinases were less stable: activity remained about 15% after incubating at 600C in... Among 8 cations tested (Ca2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Zn2+, Hg2+), the proteinases were strongly inhibited by Hg2+, then by Zn2+, Co2+ and Cu2+; on the contrary, Ca2+ and Mg2+ increased their activity Proteinases were strongly inhibited by EDTA and PMSF Some bands of the proteinases were identified in polyacrylamide gels by incorporating 0.1% gelatin in to sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide . XENORHABDUS SP. CA: MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEINAZ NGOẠI BÀO TỪ VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thuỳ Dương Khoa Sinh học, Ttường Đại học Khoa. tính chất của proteinaz do vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng tiết ra, trong bài vi t này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu về proteinaz được tiết ra từ vi khuẩn Xenorhabdus sp. . trừ sinh học không thể không quan tâm tìm hiểu các vi khuẩn cộng sinh với chúng. Trong bài vi t trước [14] chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu một số tính chất của proteinaz được tiết ra từ vi