KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA PLASMID SPV Ở CÁC SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ NƯỚC VÀ THUỶ SẢN Nguyễn Tiến Dũng Phòng vi sinh, Chi nhánh Kiểm tra chất lượng và Vệ sinh thuỷ sản 4, TP HCM Trần Linh Thước Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM MỞ ĐẦU Salmonella là vi sinh vật gây bệnh đường ruột quan trọng về các khía cạnh bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường, vệ sinh an toàn thực phẩm, Vi khuẩn này phân bố rộng khắp trong tự nhiên, có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người, động vật máu nóng, động vật máu lạnh dưới nước và trên cạn [1]. Sự xâm nhiễm Salmonella vào cơ thể vật chủ và gây bệnh được thực hiện chủ yếu qua đường tiêu hoá với biểu hiện phổ biến nhất là gây tiêu chảy, đôi khi là thương hàn và phó thương hàn. Để gây bệnh, Salmonella cần phải xâm nhiễm thành công vào bên trong thành ruột, thích nghi và vô hiệu hoá hệ thống phòng vệ của vật chủ, sau đó nhân lên và phát tán đến các mô đích [4,5]. Các quá trình này cần đến vai trò của nhiều gen gây bệnh của Salmonella hiện diện trên bộ gen và trên plasmid. Plasmid spv (Salmonella Plasmid Virulence) chứa operon spv có vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của plasmid này ở Salmonella do làm tăng cường độ gây bệnh sau khi vi khuẩn xâm nhiễm thành công vào bên trong tế bào chủ. Plasmid spv được tìm thấy ở hầu hết các kiểu huyết thanh Salmonella được phân lập được từ động vật nhưng hầu như không hiện diện ở các kiểu huyết thanh có ký chủ chuyên biệt là người [3]. Locus spv trên plasmid gây bệnh gồm có 5 gen là spvRABCD, trong đó 4 gen spvABCD cấu trúc thành một operon. Gen spvR nằm ở một vị trí tách biệt, mã hoá cho một protein điều hoà sự biểu hiện của operon spvABCD [5]. Operon này được biểu hiện mạnh nhất khi Salmonella đã xâm nhiễm vào bên trong tế bào vật chủ làm tăng tốc độ tăng trưởng của Salmonella và chống lại hệ thống phòng vệ của vật chủ [2]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày các kết quả khảo sát sự phân bố của plasmid spv trên các dòng Salmonella phân lập được từ nước và thuỷ sản. Nghiên cứu này nhằm góp phần làm sáng tỏ vai trò của các gen gây bệnh ở Salmonella. Việc xác định chính xác các kiểu huyết thanh Salmonella gây bệnh cho người và tần suất hiện diện của chúng trong tự nhiên tạo cơ sở cho việc đánh giá mối nguy hiểm thực sự của các dòng Salmonella có nguồn gốc từ môi trường tự nhiên nhiễm vào trong thực phẩm. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật: 140 chủng vi sinh vật đã được sử dụng, gồm 110 chủng Salmonella, 9 chủng E. coli, 4 chủng Staphylococcus aureus, 5 chủng Vibrio cholerae, 2 chủng V. paraheamolyticus, 2 chủng V. vulnificus, 1 chủng Rhodococcus equi, 2 chủng Streptococcus fecalis, 4 chủng Shigella spp, 1 chủng Listeria monocytogenes, 1 chủng L. inocua. Các chủng này được nhận từ Phòng Vi khuẩn đường ruột Viện Pasteur TP HCM, Trường Đại học Y Dược TP HCM, Phòng thí nghiệm Vi sinh Chi nhánh Kiểm tra Chất lượng và Vệ sinh Thuỷ Sản 4 - TP HCM, Phòng thí nghiệm Thực phẩm Alfred Jogensen, Denmark, Trung tâm Lưu trữ chủng Quốc gia Norway. Mồi: Hai cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu này có các trình tự là: invA1: 5'- TTGTTACGCCTATTTTGAGCA-3', invA2: 5'- CTGAGTGCTACCTTGCCTGATG-3' nhằm phát hiện Salmonella spp bằng phương pháp PCR và spvC1: 5’- CGGAAATAC CATCTACAAATA-3’, spvC2: 5'- CCCAAACCCATACTTACTCTG-3' nhằm phát hiện plasmid spv . Các mồi này được cung cấp bởi Genset Olygos Singapore Biotech. Pte. LT. Mẫu thử nghiệm: Mẫu nước được thu từ các ao nuôi tôm thuộc khu vực TP. HCM và tỉnh Long An. Mẫu thực phẩm được thu từ các lô hàng thực phẩm chế biến xuất khẩu được kiểm dịch tại Chi nhánh Kiểm tra chất lượng và Vệ sinh thuỷ sản 4, TP. HCM. Xử lý mẫu: 500ml nước được lọc qua màng lọc hay 25g mẫu thực phẩm được tăng sinh trong môi trường Buffered Pepton Water (BPW) (Merck, Đức) ở 37 o C trong 16-18 giờ. Hút 0,5ml dịch sau tăng sinh vào ống eppendorf, ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào, rửa sinh khối với 0,5ml nước cất vô trùng. Huyền phù sinh khối sau khi rửa với 0,5ml nước cất vô trùng hay đệm TE (0,1mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH 8,0), đun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Dịch sau khi đun được ly tâm ở tốc độ 10000vòng/ phút trong 5 phút, phần dịch nỗi được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR: Việc khuếch đại bản sao của các gen được thực hiện bằng phản ứng PCR với các thành phần như sau: 2,5mM Tris, 5mM KCl, 2,5mM MgCl2, 0,1mM mercaptoethanol, 25g/ml tinh dịch cá hồi, 1l dNTP có 1mM mỗi loại, 1,5l mỗi mồi có nồng độ 6pM, 3l khuôn DNA. Tổng thể tích trong một phản ứng là 25l. Phản ứng khuếch đại được tiến hành ở 95 o C trong 5 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: biến tính ở 95 o C trong 1 phút, bắt cặp mồi và khuôn ở 44 o C, kéo dài ở 72 o C trong 1 phút. Trước khi kết thúc phản ứng được duy trì 72 ov C trong 10 phút. Sản phẩm sau khi khuếch đại được phân tích bằng điện di gel agarose 2% trong đệm TAE (Tris Acetic acid EDTA). Kết quả dương tính được ghi nhận khi có sản phẩm khuếch đại 620bp, phù hợp với kích thước tương ứng với mồi được thiết lập. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự đặc hiệu của cặp mồi spvC đối với các Salmonella mang plasmid spv Khảo sát được tiến hành trên 9 chủng Salmonella và 8 chủng vi sinh vật không phải Salmonella . Các vi sinh vật này là những chủng chuẩn và nguồn gốc xuất xứ. Kết quả được thể hiện trên Hình 1 và Bảng 1: Hình 1: Sản phẩm 620bp khuếch đại với cặp mồi spvC. T: Thang DNA, 1: S. typhimurium, 2: S. typhi, 3: S. paratyphi C, 4: S. paratyphi B, 5: S. dublin, 6: S. adabraka, 7: S. enteritidis. Bảng 1: Kết quả khuếch đại PCR gen spvC trên các chủng chuẩn Năm trong số 9 chủng Salmonella được khảo sát cho kết quả dương tính với cặp mồi spvC là S. typhimurium, S. enteritidis, S. paratyphi C, S. dublin và S. cholerasuis. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Shoba C. Swamy [6], Chen Shun Chiu [3], Strephen J. Libby [7] cho thấy rằng cả 5 kiểu huyết thanh Salmonella đều mang plasmid spv, trong khi đó 4 kiểu huyết thanh Salmonella còn lại là những dòng không mang plasmid này. Cả 9 chủng không phải Salmonella đều không cho tín hiệu khuếch đại với với cặp mồi spvC. Kết quả này chứng tỏ cặp mồi spvC đặc hiệu cho plasmid spv của Salmonella. Sự hiện diện của plasmid spv trong các dòng Salmonella đưỵc phân lập từ nước và thực phẩm thuỷ sản. Khảo sát được tiến hành trên 102 chủng Salmonella, 8 chủng E. coli, 4 chủng Staphylococcus aureus, 4 chủng Vibrio cholearae, 4 chủng V. parahearmolyticus đã được phân lập từ nước các ao nuôi thuỷ sản và từ các loại thực phẩm có nguồn gốc thuỷ sản. Kết quả được thể hiện trên Hình 2 và Bảng 2. Hình 2: Sự hiện diện của plasmid spv ở các dòng Salmonella được phân lập từ nước tự nhiên và thực phẩm. T: thang DNA, caực gieỏng 1; 3; 5: sản phẩm 520bp khuếch đại với mồi invA của Salmonella, các giếng 2, 4, 6: sản phẩm 620bp khuếch đại với mồi spvC của Salmonella, 7: E. coli khuếch đại với cặp mồi spvC. Bảng 2: Sự hiện diện plasmid spv ở các chủng vi sinh vật khảo sát Kết quả ở Bảng 2 cho thấy các vi sinh vật không phải Salmonella đều không mang plasmid spv. Kết quả này một lần nữa khẳng định plasmid gây bệnh spv chỉ có ở Salmonella mà không có ở các vi sinh vật gây bệnh khác. Ngoài ra, chỉ có 5/102 chủng Salmonella có nguồn gốc từ nước tự nhiên và thực phẩm có mang plasmid spv, chiếm tỉ lệ 4,9%. Nghiên cứu của Shoba W. Swamy và các đồng sự đã cho thấy 100% Salmonella phân lập được từ trứng đều có mang plasmid spv, trong khi đó 0% Salmonella được phân lập từ nước trong môi trường tự nhiên hoặc nước thải sinh hoạt mang plasmid này [6]. Nghiên cứu của Cheng – Hsun Chiu [...]... mẫu nước lấy từ các ao nuôi tôm và sông lạch tại huyện Cần Giờ, TP HCM và huyện Cần Đước tỉnh Long An để khảo sát tần suất hiện diện của Salmonella mang plasmid spv trong tự nhiên Kết quả khảo sát được thể hiện trên Bảng 4 Bảng 4: Sự hiện diện Salmonella spp và plasmid spv trong nước tự nhiên Kết quả trên Bảng 4 cho thấy mặc dù tần suất hiện diện Salmonella trong nước rất cao (47,6% số mẫu khảo sát) ... 500ml nước tự nhiên sau bước tăng sinh trên môi trường Buffered Pepton Water Sự tương đồng nhau về độ nhạy phát hiện Salmonella spp và plasmid spv là một sự thuận lợi rất lớn để thiết lập qui trình phát hiện phân biệt đồng thời Salmonella mang plasmid spv với Salmonella không mang plasmid này Khảo sát sự hiện diện của Salmonella mang plasmid spv trong nước tự nhiên Chúng tôi cũng đã tiến hành khảo sát. .. 111 chủng Salmonella (102 chủng phân lập được từ nước tự nhiên, thực phẩm có nguồn gốc thuỷ sản) cho thấy cặp mồi spvC là đặc hiệu cho việc phát hiện plasmid spv Thực nghiệm cũng cho thấy plasmid này chỉ hiện diện trong Salmonella mà không hiện diện trong các vi sinh vật gây bệnh khác Trong số các chủng Salmonella có nguồn gốc từ nước và thực phẩm thuỷ sản, chỉ có 4,9% số chủng mang plasmid spv Điều... 2% số Salmonella mang plasmid spv Nói cách khác, chỉ có khoảng 1% mẫu nước có sự hiện diện của Salmonella chứa plasmid spv Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của Shoba C Swamy khi không phát hiện được chủng nào mang plasmid spv trong số 84 chủng Salmonella phân lập được từ nước thải sinh hoạt [6] Kết quả này một lần nữa khẳng định rằng rất hiếm Salmonella phân bố trong tự nhiên mang plasmid. .. định rằng các Salmonella có nguồn gốc tự nhiên có độc lực thấp hơn các dòng Salmonella trong bệnh phẩm hay có nguồn gốc từ các động vật máu nóng Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng độ nhạy phát hiện Salmonella mang plasmid spv và phát hiện Salmonella spp bằng PCR là tương tự nhau ở mức 1-5 tế bào/25g thực phẩm hay 500ml nước Kết quả này tạo cơ sở để phát hiện phân biệt Salmonella spp và Salmonella. .. vật khác nhau, sau đó thực hiện việc phát hiện Salmonella spp bằng cặp mồi invA và plasmid spv bằng cặp mồi spvC Kết quả được thể hiện trên Bảng 3 Bảng 3: Độ nhạy phát hiện Salmonella mang plasmid spv trong nước và mẫu thực phẩm Bảng 3 cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy phát hiện plasmid spv với cặp mồi spvC tương tự độ nhạy phát hiện Salmonella spp bằng mồi invA Mức phát hiện thấp nhất là 1-5 tế bào/25g.. .và đồng sự cho kết quả là 55% số chủng Salmonella phân lập được từ phân trẻ em bị bệnh viêm đường tiêu hoá có mang plasmid spv [3] Các kết quả này cùng với kết quả khảo sát của chúng tôi đã cho thấy rằng tỉ lệ Salmonella mang plasmid spv trong tự nhiên rất thấp Vậy plasmid spv không đóng vai trò quyết định trong quá trình gây bệnh cho con người Tuy nhiên các nghiên cứu so sánh khả năng gây bệnh ở các. .. và Salmonella mang plasmid spv sau này Cùng với việc khảo sát trên các chủng thuần, chúng tôi cũng đã khác sát sự hiện diện của các Salmonella mang plasmid spv trực tiếp trên mẫu nước tự nhiên Kết quả cũng cho thấy rằng chỉ có khoảng 1% trong số các mẫu có Salmonella mang plasmid này Kết quả này tái khẳng định chỉ có một tỉ lệ rất thấp Salmonella trong tự nhiên mang plasmid gây bệnh spv TÀI LIỆU THAM... năng gây bệnh ở các dòng Salmonella mang plasmid spv và các dòng không mang plasmid cho thấy chúng đóng vai trò trong việc tăng cường biểu hiện bệnh lý trên động vật thí nghiệm Những Salmonella có plasmid spv thường có LD50 thấp hơn khoảng 10-100 lần so với các dòng không mang plasmid Tỉ lệ Salmonella trong nước tự nhiên mang plasmid spv thấp chứng tỏ rằng cường độ gây độc của các Salmonella có nguồn gốc... gây bệnh spv Điều điều đó có nghĩa các Salmonella hiện diện trong trong môi trường tự nhiên có độc lực kém hơn các Salmonella phân lập được từ các ký chủ là động vật máu nóng Tuy nhiên để đi đến khẳng định rằng các Salmonella phân bố tự nhiên trong môi trường ít có khả năng gây bệnh cho con người cần phải có nhiều nghiên cứu sâu hơn trên các gen gây bệnh khác ở Salmonella KẾT LUẬN Việc khảo sát trên . được phân lập từ nước các ao nuôi thuỷ sản và từ các loại thực phẩm có nguồn gốc thuỷ sản. Kết quả được thể hiện trên Hình 2 và Bảng 2. Hình 2: Sự hiện diện của plasmid spv ở các dòng Salmonella. KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA PLASMID SPV Ở CÁC SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ NƯỚC VÀ THUỶ SẢN Nguyễn Tiến Dũng Phòng vi sinh, Chi nhánh Kiểm tra chất lượng và Vệ sinh thuỷ sản 4, TP HCM. bài báo này, chúng tôi trình bày các kết quả khảo sát sự phân bố của plasmid spv trên các dòng Salmonella phân lập được từ nước và thuỷ sản. Nghiên cứu này nhằm góp phần làm sáng tỏ vai trò của