ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON DỊNG NGƠ NHẬP NỘI HR8, HR9 Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh Viện Di truyền nông nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Khả tái sinh trồng nói chung phụ thuộc nhiều vào kiểu gen thực vật Đối với ngô, vấn đề tái sinh gặp nhiều khó khăn, ngoại trừ số dịng có khả tái sinh cao, sử dụng làm vật liệu chuyển gen như: A188, H99, HiII…hầu hết dịng ngơ khác có khả tái sinh (1) Mặt khác, khả tái sinh cịn phụ thuộc vào mơi trường ni cấy số yếu tố khác Việc nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tái sinh ngơ cịn hạn chế Trong khn khổ báo chúng tơi trình bày kết nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường tuổi phôi nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo tái sinh từ phôi non sở dịng ngơ nhập nội có khả tái sinh cao HR8 HR9 Hai dịng ngơ có nguồn gốc ôn đới, trồng xác định thời vụ sinh trưởng thích hợp điều kiện Việt nam (10) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các dòng ngơ sử dụng nghiên cứu gồm: hai dịng ngơ nhập nội HR8 HR9 dịng có khả tái sinh cao, Viện Công nghệ liên bang Thuỵ sỹ ETH cung cấp Cây ngô mẹ cho bắp thí nghiệm trồng nhà lưới từ tháng 10/2000 đến tháng 4/ 2003 Phương pháp Bắp non sau thụ phấn khoảng 18-24 ngày thu để tách phơi Mẫu bắp thí nghiệm giữ 40C thời gian từ 2-10 ngày trước tách phôi Khử trùng bề mặt ngồi bắp ethanol 700, bóc bỏ bao ngồi tách phơi điều kiện vô trùng Phôi non cấy môi trường nuôi cấy với phần tế bào vảy hướng lên trên, phần trụ phôi tiếp xúc với bề mặt môi trường (Green and Phillips, 1975) Các phơi có kích thước khác (từ 0,5-3mm) sử dụng thí nghiệm Mật độ cấy 15 phôi/đĩa Petri chứa 8mml môi trường .Mỗi công thức thí nghiệm làm với 12 đĩa, tương ứng với 180 phôi tách từ bắp Môi trường nuôi cấy Hai loại môi trường sử dụng: - Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) - Môi trường N6 (Chu et al., 1975) bổ sung chất điều hoà sinh trưởng số phụ gia khác tuỳ giai đoạn nuôi cấy (theo Armstrong and Green, 1985 có cải tiến): • Mơi trường tạo mơ sẹo: gồm mơi trường khác thành phần khống vitamin - Môi trường CMS: môi trường MS bổ sung 20 g/l sucrose, mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline 10mg/l AgNO3 - Môi trường CN6: môi trường N6 bổ sung 20 g/l sucrose, mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l • Mơi trường tái sinh chồi (SM): môi trường N6 bổ sung 60 g/l sucrose, g/l myo-inositol • Mơi trường kéo dài chồi tạo hồn chỉnh (RM): mơi trường 1/2MS bổ sung 20 g/l sucrose, g/l myo-inositol Tất môi trường sử dụng chất giá thể phytagel 0,2%, có pH=5,8 Điều kiện ni cấy Mẫu ni nhiệt độ 260C  Đối với giai đoạn tạo mơ sẹo mơ sẹo phơi hố mẫu phơi non nuôi cấy tối thời gian từ 2-3 tuần Để tái sinh chồi tạo hồn chỉnh mơ sẹo phơi hố ni cấy điều kiện chiếu sáng thời gian 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 1200-1600 lux KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng nitrat bạc lên khả tạo mô sẹo tái sinh dòng HR8 Bắp non dòng HR8 sau thụ phấn 18-20 ngày thu để tách phôi Các phôi có kích thước khoảng 1-2 mm chọn ni cấy mơi trường tạo mơ sẹo CN6 có bổ sung AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l (các phơi có kích thước lớn nhỏ bị loại bỏ) Kết thu trình bày bảng hình Bảng Ảnh hưởng AgNO3 đến khả tạo mơ sẹo tái sinh dịng HR8 Kết bảng cho thấy phản ứng tạo mô sẹo tái sinh dòng HR8 cải thiện cách rõ rệt bổ sung AgNO3 nồng độ 1-15mg/l vào môi trường nuôi cấy: tỷ lệ tạo mô sẹo tăng từ 56,6% lên 85,5%, tỷ lệ tái sinh tăng từ 18,6% lên 22,6% (trong mơi trường khơng có có 1mg/l AgNO3) Tần số tạo mơ sẹo tái sinh đạt giá trị tương đối cao (từ 85.5% - 90.5% 22.6% - 26.6%) thay đổi không đáng kể bổ sung 5-15 mg/l AgNO3 vào môi trường nuôi cấy Song, nồng độ 10mg/l AgNO3 khả tạo mơ sẹo tái sinh dòng HR8 đạt giá trị lớn (90.5% 26.6%) giảm dần tăng nồng độ AgNO3 từ 20mg/l lên 30mg/l Hình Ảnh hưởng AgNO3 đến khả tạo mơ sẹo tái sinh dịng HR8 Khi nghiên cứu ảnh hưởng AgNO3 đến hình thành mơ sẹo từ phơi non dịng B73 (Songstad et al 1991), từ hoa non dòng HiII (Songstad et al 1992) từ phơi non dịng A188 (Vain et al 1989) tác giả có nhận xét tương tự (7, 8, 11) Từ kết thu chúng tơi chọn mơi trường tạo mơ sẹo CN6 có bổ sung10mg/l AgNO3 để nghiên cứu tiếp ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy nitrat bạc đến khả tạo mơ sẹo tái sinh dịng HR8 Ảnh hưởng thành phần môi trường nitrat bạc lên khả tạo mô sẹo tái sinh dịng HR8 Phơi non dịng HR8 có kích thước khoảng 1-2 mm chọn nuôi cấy môi trường tạo mơ sẹo có thành phần khống vitamin khác (MS N6) bổ sung 10mg/l AgNO3 Kết thu trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng thành phần môi trường AgNO3 đến khả tạo mơ sẹo tái sinh dịng HR8 Trong thí nghiệm chúng tơi quan sát thấy mơ sẹo bắt đầu xuất sau 1-2 tuần nuôi cấy Tuy nhiên, chưa quan sát khác biệt mặt hình thái loại mơ sẹo tạo thành giai đoạn Vì mẫu cấy chuyển sang mơi trường hình thành dạng mô sẹo khác khả tạo mô sẹo quan sát rõ sau 1-2 tuần ni cấy (hình 4A, 4B, 4C) Kết bảng cho thấy có khác biệt khơng đáng kể khả tạo mô sẹo tái sinh dịng HR8 ni cấy mơi trường có thành phần khống vitamin khác nhau: a) Tỷ lệ tạo mô sẹo: đạt 69,4 % 60,0%, b) Tỷ lệ tái sinh cây: đạt 18,5 % 20,8% môi trường MS N6 không bổ sung AgNO3 tương ứng Tần số tạo mô sẹo tái sinh phôi nuôi cấy môi trường MS N6 có bổ sung 10mg/l AgNO3 đạt kết tương tự Hình 3: ẢNh hưởng thành phần mơi trường AgNO3 đến khả tái sinh dòng HR8 Sự có mặt AgNO3 mơi trường ni cấy cải thiện rõ rệt khả tạo mô sẹo tái sinh dịng ngơ HR8 Tỷ lệ tạo mô sẹo tăng từ 69,4% lên 88,8% (môi trường MS) 60,0% lên 90,5% (môi trường N6) nuôi cấy mơi trường khơng có có bổ sung AgNO3 tương ứng (hình 3) Tần số tái sinh đạt giá trị cao nuôi cấy môi trường CN6 có bổ sung 10mg/lAgNO3 Điều giải thích AgNO3 kích thích q trình tạo mơ sẹo cách ngăn cản hình thành ethylen nội sinh (tạo tổn thương mẫu ni cấy q trình ni cấy in vitro) (Songstad et al, 1992) Ảnh hưởng tuổi phơi (kích thước phôi) lên khả tạo mô sẹo tái sinh dịng HR8 Phơi non độ tuổi khác 16, 18, 20, 22 24 ngày (phơi có kích thước từ 0,5-5mm tương ứng) cấy mơi trường tạo mô sẹo CN6 bổ sung 10 mg/l AgNO3 Sau 2-3 tuần nuôi cấy quan sát thấy sinh trưởng hình thái khối tế bào mơ sẹo tạo thành từ phơi có kích thước khác khác Kết trình bày bảng hình Bảng Ảnh hưởng tuổi phơi (kích thước phơi ni cấy) lên khả tạo mơ sẹo tái sinh dịng HR8 Hình A Phơi ni cấy; B, C Mơ sẹo mơ sẹo phơi hố tạo thành từ phơi non; D Cây tái sinh; E, F, G Mô sẹo tạo thành từ phơi ni cấy có kích thước 0,5; 1-2 mm tương ứng; Đối với phôi nuôi cấy độ tuổi 16 ngày sau thụ phấn (có kích thước 0,5mm) khối tế bào mơ sẹo tạo thành nhỏ, sinh trưởng chậm có dạng nhầy (hình 4E) Khi tái sinh chúng tạo thành cụm chồi với chồi không hữu hiệu, sức sống rễ Tỷ lệ tạo mô sẹo tái sinh thấp đạt 29,4% 11,3% Bên cạnh khả tạo mô sẹo tái sinh từ phơi non độ tuổi 18-20 ngày (có kích thước khoảng 12mm) tương đối tốt Sau 7-10 ngày bề mặt mẫu nuôi cấy xuất khối mơ sẹo dạng hạt nhỏ, xốp, có màu trắng ngà (hình 4F) Khối tế bào sinh trưởng nhanh, sau vài lần cấy chuyển phát triển thành phơi dạng hình cầu (hình 4C) Các tế bào phôi tách cách dễ dàng, phát triển thành hồn chỉnh (hình 4D) Tỷ lệ tạo mô sẹo tái sinh đạt 54,4-83,3% 17,7-26,6% Ngược lại, với phôi nuôi cấy ban đầu độ tuổi 20 ngày (có kích thước 3mm) khả tạo mơ sẹo kém, tế bào phơi ni cấy phồng to lên, rễ xuất (hình 4G) Một số mẫu nuôi cấy xuất khối tế bào mô sẹo dạng màu trắng, cứng, số khối mơ sẹo có khả tái sinh thành cây, tỷ lệ tạo thấp (5,5%) Với phơi ni cấy có kích thước lớn (5mm) khơng có khả ạo mơ sẹo tái sinh Từ kết cho phép chúng tơi đến kết luận phơi có độ tuổi 18-20 ngày (kích thước khoảng 1,0-2,0 mm tương ứng) nuôi cấy môi trường CN6 bổ sung 10mg/l AgNO3 cho hiệu tái sinh tốt Nhận xét tương tự nghiên cứu trước số tác giả (Todorova CS, 1998) KẾT LUẬN Trên sở kết thu rút số kết luận sau: Việc bổ sung 1-20 mg/l AgNO3 vào môi trường tạo mơ sẹo có tác dụng kích thích phản ứng tạo mơ sẹo tái sinh dịng nhập nội HR8 Tần số tạo mô sẹo tái sinh đạt giá trị cao nồng độ 10mg/l AgNO3 (90.5% 26.6%) Khả tái sinh dòng HR8 thay đổi không đáng kể nuôi cấy phôi non mơi trường tạo mơ sẹo có thành phần khống vitamin khác (MS N6) có bổ sung 20 g/l sucrose, mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline 10 mg/l AgNO3 Sự có mặt 10mg/l AgNO3 mơi trường N6 có tác dụng kích thích khả tạo mơ sẹo tái sinh chồi Phôi non sau thụ phấn 18-20 ngày (có kích thước tương ứng khoảng 1-2mm) có khả tạo mô sẹo tái sinh tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Armstrong CL., and Green CE (1985) Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline Planta 164: 207-214 Chu CC., Wang CC., Sun CS., Hsu C.,Yin KC., Chu CY., Bi FY (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen source Sci Sin 18: 659-668 Do Nang Vinh (1989) Factors affecting the formation and differentiation of embryogenic callus in cultured in vitro of immature maize embryos Genetics and breeding, vol 22, No 1, Sofia Green CE., and Phillips RL (1975) Plant regeneration from tissue culture of maize Crop Science 15:417-421 Lowe K., Taylor DB., Rayan P., Paterdon KE (1985) Plant regeneration via organogenesis and embryogenesis in the maize inbred line B73 Plant Science 41.2: 125-132 Murashige, T & Skoog, F.C (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture Physiologia Plantarum 15:473-497 Songstad DD., Armstrong CL., and Petersen WL (1991) Silver nitrate increases type II callus production from immature embryos of maize inbred B73 and its derivatives Plant Cell Reports 9: 699-702 Songstad DD., Petersen WL and Armstrong CL (1992) Establishment of friable embryogenic (type II) callus from immature tassels of Zea mays (Poaceae) American Journal of Botany 79 (7): 761-764 Todorova L., Kruleva M., Krapchev B., Nedev T (1998) Maize immature embryo culture Maize Newsletter 72: 76 10 Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003) Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển tái sinh từ phơi non hai dịng ngơ nhập nội HR8, HR9 điều kiện Việt nam Tạp chí Nơng nghiệp &PTNT, số 9, tr 726-729 11 Vain P., Flament P., and Soudain P (1989) Role of ethylene in embryogenic callus initiation and regeneration in Zea mays L Jour of Plant Physiology 135: 537-540 12 Vain P., Yean H., and Flament P (1989) Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus in Zea mays L by AgNO3 Plant Cell Tissue and Organ Culture 18: 143-151 SUMMARY The affect of medium component and embryo age on callus induction and plant regeneration from immature embryos of HR8 maize inbred line Pham Thi Ly Thu, Pham Minh Thoi, Le Huy Ham, Do Nang Vinh Institute of Agricultural Genetics The effective regeneration system plays important role in plant transformation In general, maize (Zea mays L.) is recalcitral plant in regeneration, except some high regenerable lines as A188, H99, HiII… which have been used for transformation Besides, plant regeneration capacity depends on genotype It was also affected by medium component and the other factors HR8 and HR9 are high regenerable lines were used in this study There was no significant difference among callus induction rates for immature embryos cultured on MS or N6 medium containing 20 g/l sucrose, mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline, 10 mg/l AgNO3 and 0.2% phytagel Incorporating 10 mg/l AgNO3 into phytagel solidified N6 medium supplemented 20 g/l sucrose, mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline promoted callus production from cultured immature embryos of HR8 line Under these conditions, approximately 90.5% of the xplants produced calli after to weeks incubation in the dark at 280C and plant regeneration frequency was 26.6% The optimum embryo age for scutellar callus initiation was 18-20 days post-pollination (approximately 1-2 mm size respective) Người thẩm định nội dung khoa học: TS Đoàn Duy Thanh  ... khổ báo chúng tơi trình bày kết nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường tuổi phôi nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo tái sinh từ phôi non sở dịng ngơ nhập nội có khả tái sinh cao HR8 HR9 Hai dòng. .. AgNO3 từ 20mg/l lên 30mg/l Hình Ảnh hưởng AgNO3 đến khả tạo mô sẹo tái sinh dòng HR8 Khi nghiên cứu ảnh hưởng AgNO3 đến hình thành mơ sẹo từ phơi non dòng B73 (Songstad et al 1991), từ hoa non dòng. .. mô sẹo tái sinh phôi nuôi cấy mơi trường MS N6 có bổ sung 10mg/l AgNO3 đạt kết tương tự Hình 3: ẢNh hưởng thành phần môi trường AgNO3 đến khả tái sinh dịng HR8 Sự có mặt AgNO3 môi trường nuôi