TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Nguyễn Quỳnh Anh (1), Nguyễn Đức Hoàng (2), Trần Linh Thước (1,2) (1) Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học,Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM (2) Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử,Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp thủy hải sản nói chung, ngành công nghiệp nuôi tôm nói riêng phát triển mạnh mẽ trên khắp thế giới đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sự gia tăng trong hoạt động nuôi trồng lại dẫn tới sự bùng nổ các bệnh gây ra bởi vi khuẩn và vi rút. Dù xuất hiện muộn nhưng hội chứng đốm trắng đã nhanh chóng lan rộng khắp nơi với những thiệt hại ước tính khoảng 1 tỉ USD mỗi năm trên phạm vi toàn thế giới. Trước tình hình đó, việc phát hiện bệnh sớm để có các biện pháp xử lý thích hợp đã trở nên ngày càng cấp thiết [1]. Các phương pháp được dùng để phát hiện bệnh là mô học, phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), phương pháp lai và phương pháp miễn dịch [1]. Với thế mạnh là có thể dùng để phát hiện bệnh ngoài phòng thí nghiệm, phương pháp miễn dịch có thể được các hộ nuôi trồng sử dụng trực tiếp tại nơi sản xuất để phát hiện bệnh nhanh ở tôm nuôi mà không cần phải gửi mẫu tới các phòng thí nghiệm. Do đó, có thể nhanh chóng có những biện pháp đối phó thích hợp, giảm thiểu được các tổn thất. Trong phương pháp miễn dịch phát hiện bệnh, kháng thể được sử dụng để phát hiện nhanh kháng nguyên có nguồn gốc từ bệnh (như bản thân vi rút, một loại protein vỏ nào đó của vi rút). Nhiệm vụ của các nhà khoa học là phải tìm được đúng loại kháng thể thích hợp. Hiện nay, có một điều bất lợi là chưa nuôi được tế bào tôm để nhân vi rút dùng làm kháng nguyên để tạo kháng thể, do đó phương pháp khả thi hơn là ứng dụng các kỹ thuật di truyền để thu nhận protein vỏ của vi rút làm kháng nguyên để tạo kháng thể. Các nghiên cứu trước đây cho biết vi rút WSSV gây hội chứng đốm trắng không chỉ ở tôm mà còn trên nhiều loài giáp xác khác. Vi rút này có kích thước khá lớn với ADN bộ gen vòng, mạch đôi kích thước khoảng gần 300kb [2, 3]. Virion WSSV có 5 protein cấu trúc chính, được gọi tên theo trọng lượng phân tử khi điện di SDS-PAGE, trong đó có 2 loại protein hiện diện tại vỏ của vi rút là VP19 (19kDa) và VP28 (28kDa) [4, 5, 6, 7]. Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rút WSSV (White Spot Syndrome Virus) trong Escherichia coli để phục vụ mục tiêu tạo kháng thể sử dụng trong phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh WSSV. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 [F- endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi l- recA1 gyrA96 D lacU169 (f80 lacZ DM15)] được sử dụng để tạo dòng các plasmid mang đoạn gen VP19; Escherichia coli HB101 [sup E44 hsdS20 (rB-/mB-) recA13 ara14 proA2 lacY1 gaIK2 rpsL20 xyl5 mH1] được dùng làm tế bào chủ để biểu hiện gen mã hóa protein VP19 bằng vector biểu hiện pEZZ 18 (Genbank M74186) [8]. E. coli được nuôi cấy trong môi trường Luria-Bertani (LB) [1% tryptone, 0,5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100g/ml ampicillin (khi cần) để làm nhân tố chọn lọc. Nguồn ADN. Mẫu tôm bệnh có nguồn gốc từ Sóc Trăng. Tách chiết ADN từ mẫu tôm và kiểm bằng PCR nhờ bộ kit phát hiện vi rút gây bệnh đốm trắng của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia TP. HCM. Mẫu ADN dương tính được sử dụng làm ADN khuôn để nhân bản và thu nhận đoạn gen VP19 bằng phản ứng PCR. Thiết kế plasmid. Với mục đích biểu hiện protein vỏ VP19 của vi rút WSSV dưới dạng protein dung hợp Protein A- VP19, plasmid pZ-VP19 được thiết kế như sau. Đoạn gen VP19 được khuếch đại và thu nhận bằng phản ứng PCR sử dụng ADN bản mẫu được tách chiết từ mẫu tôm bệnh và cặp mồi VP19-2f, 5’ -ACAGGGATCCAATGGCCACC- ACG-3 để tạo vị trí cắt BamHI và VP19-2r, 5’ - TTCTAAGCTTTTACT-GCCTCCTCTTGG-3 để tạo vị trí cắt HindIII. Thành phần phản ứng PCR gồm nước cất, đệm 10X, dNTP 10X (2mM mỗi loại), ADN bản mẫu (50ng/l), mồi xuôi và mồi ngược (10pmole/l), Pfu ADN polymerase (3U/l). Tinh chế sản phẩm PCR thu được và cắt bằng BamHI và HindIII. Đoạn gen VP19 BamHI/HindIII được nối vào plasmid pEZZ 18 tại BamHI và HindIII nhờ T4 ADN ligase. Thành phần phản ứng nối gồm plasmid pEZZ 18, đoạn gen VP19, PEG 6000 30%, đệm 10X và enzym nối T4 ADN ligase. Sản phẩm nối sau đó được biến nạp vào E. coli DH5. Các phương pháp tuyển chọn và kiểm tra dòng mang gen mục tiêu. Sản phẩm nối sau khi được biến nạp vào E. coli DH5 sẽ được chọn lọc sơ bộ dựa trên kiểu hình kháng ampicillin và màu sắc xanh trắng của khuẩn lạc. Các khuẩn lạc dự tuyển được kiểm chứng bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi của gen VP19-2f/VP19-2r. Phương pháp bản đồ cắt hạn chế cũng được sử dụng để kiểm tra plasmid thu được [9]. Sau khi được tạo dòng, gen VP19 được giải trình tự trên máy giải trình tự ALF express II, Amersham Biosciences và phân tích, so sánh kết quả bằng chương trình Jellyfish (Biowife). Điện di phân tích protein bằng phương pháp SDS - PAGE. Plasmid pZ-VP19 được tách chiết từ E. coli DH5 bằng phương pháp SDS - kiềm, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng quang phổ kế. Biến nạp pZ-VP19 vào E. coli HB101, nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa 100g/ml ampicillin đến khi đạt tới pha ổn định. Protein dung hợp được tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường nhờ trình tự tín hiệu tiết có trên pZ-VP19 [8]. Tủa protein bằng muối amonium sulfat bão hòa và điện di phân tích protein trên gel polyacrylamid với sự hiện diện của Sodium Dodecyl Sulfate[9] cùng với thang chuẩn protein và mẫu đối chứng là protein thu từ môi trường nuôi cấy E. coli HB101 chứa plasmid pEZZ 18 không có đoạn chèn để xác định sự hiện diện của protein dung hợp Protein A-VP19 trong môi trường nuôi cấy. KẾT QUẢ Thu nhận gen mã hóa protein vỏ VP19. Khảo sát 30 mẫu ADN bị nghi nhiễm bệnh WSSV, kết quả cho thấy có 25 mẫu bị nhiễm WSSV khi được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi theo bộ kít của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM. Khi thực hiện phản ứng PCR dựa vào khuôn ADN trên với cặp mồi VP19-2f/VP19-2r, kết quả cho thấy chỉ có những mẫu tôm bị nhiễm WSSV thì mới cho sản phẩm khuếch đại của gen VP19. Chọn một mẫu ADN có kết quả dương tính ở trên làm khuôn để thu nhận đoạn gen VP19 bằng Pfu ADN polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước 387bp (Hình 1, giếng 1) được cắt bằng BamHI và HindIII. Đoạn ADN này sau đó được tinh chế qua gel agarose để dùng cho phản ứng nối nhằm tạo plasmid pZ-VP19. Tạo dòng gen VP19 vào vector biểu hiện pEZZ 18. Sản phẩm nối của gen VP19 và plasmid pEZZ 18 được biến nạp vào E. coli DH5 nhằm nhân bản với số lượng lớn bản sao đồng thời có thể tuyển chọn sơ bộ thể biến nạp dựa trên kiểu hình kháng ampicillin và màu sắc xanh trắng của khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh là thể biến nạp mang plasmid pEZZ 18 không có gen chèn; những khuẩn lạc trắng là những thể biến nạp dự kiến có mang gen VP19 (Hình 3). Để kiểm tra thể biến nạp mang gen VP19 đã qua sơ tuyển, phương pháp PCR khuẩn lạc được sử dụng với cặp mồi VP19-2f/VP19-2r. Chỉ những mẫu có mang gen VP19 mới cho ra sản phẩm PCR kích thước 387bp trên bảng điện di (Hình 2, giếng 2). Những mẫu dương tính sau kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc sẽ được tách chiết plasmid. Plasmid sau đó được cắt bởi hai enzym HindIII, BamHI và điện di trên gel agarose (Hình 4, giếng 3), so sánh với pEZZ 18 cũng được xử lý bởi hai enzym trên và gen VP19 sản phẩm PCR. Khi đó, plasmid có mang gen chèn sẽ bị cắt tạo thành hai đoạn ADN, một có kích thước tương đương gen VP19 - sản phẩm PCR, đoạn còn lại có kích thước tương ứng với pEZZ 18 (Hình 4, giếng 3). Sơ đồ plasmid pZ-VP19 được khái quát như trong Hình 5. Hình 1. Thu nhận gen VP19. 1, Sản phẩm PCR gen VP19 2, Thang DNA 100bp Hình 2. PCR khuẩn lạc kiểm tra thể biến nạp. 1, Thang DNA 100bp; 2, Sản phẩm PCR khuẩn lạc - mẫu mang gen VP19; 3, Sản phẩm PCR khuẩn lạc - kết quả âm tính, mẫu không mang gen VP19 Hình 3. Kết quả biến nạp pZ-VP19 vào E. coli. Hình 4. Kiểm tra plasmid pZ-VP19. [...]... plasmid pZ -VP19 Hình 6 So sánh trình tự gen VP19 từ tôm bị bệnh WSSV tại Vi t Nam (AY160771) với các trình tự gen từ ngân hàng gen (AF369029 và AY220744) Hình 7 Phân tích protein bằng điện di SDS-PAGE KẾT LUẬN Như vậy, chúng tôi đã thành công trong vi c tạo dòng gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rút WSSV gây hội chứng đốm trắng ở tôm sú tại Vi t Nam Vi c giải trình tự gen này cho thấy gen vp19 này... cho thấy gen vp19 này gồm 366bp mã hóa cho 122 axit amin Gen vp19 trên WSSV gây bệnh trên tôm sú tại Vi t Nam có độ đồng nhất rất cao ở mức ADN và mức protein với các gen vp19 khác đã công bố Gen vp19 được tái tạo dòng vào vector biểu hiện pEZZ 18 để biểu hiện VP19 trong tế bào chủ E coli HB101 dưới dạng protein dung hợp Protein A -VP19 được tiết ra môi trường nuôi cấy Protein này đang được tinh chế... bởi HindIII và BamHI 2, Sản phẩm PCR đoạn gen VP19 3, pZ -VP19 đư ợc cắt bởi HindIII và BamHI Giải trình tự gen mã hóa protein VP19 Đoạn gen VP19 trong plasmid pZ -VP19 được giải trình tự, kiểm tra sự đồng khuôn với gen mã hoá protein A có sẵn trong plasmid pEZZ18 Trình tự gen VP19 ở WSSV trên mẫu tôm bệnh tại Vi t Nam do chúng tôi tạo dòng và giải trình tự được công bố trên ngân hàng gen với mã số AY160771... sánh trình tự VP19 này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gen. (Hình 6) cho thấy trình tự gen VP19 ở WSSV tại Vi t Nam có sự sai khác một axit nucleic tại vị trí 212 so với trình tự AY220744 và một tại vị trí 218 so với trình tự AF369029 Biểu hiện gen mã hóa protein VP19 trong E coli HB101 Biến nạp plasmid pZ -VP19 được chiết tách từ E coli DH5 vào E coli HB101 Sự biểu hiện của gen VP19 trong plasmid... promoter lacUV5 và promoter của protein A mà không cần phải cảm ứng Protein được biểu hiện (ở dạng protein dung hợp Protein AVP19) được tiết ra ngoài môi trường nhờ trình tự tín hiệu tiết có trên plasmid Trọng lượng phân tử của protein dung hợp khoảng 33kDa (trong đó protein A khoảng 14kDa và protein vỏ VP19 là 19kDa) Khi phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE (Hình 7, giếng 2, 3), protein này thể hiện bằng... kháng nguyên phục vụ vi c phát triển kháng thể kháng VP19 và phát triển phương pháp phát hiện nhanh WSSV trên tôm sú, góp phần trong vi c giám sát, phòng ngừa dịch bệnh do WSSV tại Vi t Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Richard Hodgson, Peter Warker (2001) Molecular diagnostics training workshop for detection of WSSV (white spot syndrome virus) in Vietnam, University of Fisheries Nha Trang city Vietnam 2 Van Hulten... amplification of vp19 gene with a primer pair containing restriction sites of BamHI and HindIII The gene was subcloned into pEZZ 18 expression vector 18 at BamHI and HindIII sites The cloned vp19 gene was sequenced and registered in GeneBank as AY160771 On alignment and comparison with two reported sequences of vp19, the cloned sequence of vp19 showed a very high homology on DNA as well as on protein level... syndrome had been collected from Soc Trang province in Vietnam and were tested for the presence of WSSV virus (White Spot Syndrome Virus), which had been proved to be the main viral pathogen of the disease in North and Southeast Asia using a PCR protocol and chemicals developed by the Laboratory of Molecular Biotechnology, University of Natural Sciences, VNU-HCM Vietnam Positive sample was used to prepare... Klein Lankhorst R and Vlak J.M (2001), Virology 286: 7 - 22 3 Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X and Xu X (2001), Journal of General Virology 75: 11811 11820 4 Van Hulten M C., Reijns M., Vermeesch A M G., Zandbergen F and Vlak J M (2002), Journal of General Virology 81: 257 - 265 5 Van Hulten M C., Westenberg M., Goodall S D and Vlak J M (2000), Virology 266: 227 - 236 6 Van Hulten M C.,... expressing the vp19 envelope protein of wssv virus causing the white spot syndrome disease on black tiger shrimp (PENAEUS MONODON) Nguyen Quynh Anh (1), Nguyen Duc Hoang (2), Tran Linh Thuoc (1,2) (1) Center for Bioscience and Biotechnology, University of Natural Sciences, Vietnam National University - Ho Chi Minh City (2) Laboratory of Molecular Biotechnology, University of Natural Sciences, Vietnam National . công trong vi c tạo dòng gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rút WSSV gây hội chứng đốm trắng ở tôm sú tại Vi t Nam. Vi c giải trình tự gen này cho thấy gen vp19 này gồm 366bp mã hóa cho 122. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Nguyễn Quỳnh Anh (1), Nguyễn. diện tại vỏ của vi rút là VP19 (19kDa) và VP28 (28kDa) [4, 5, 6, 7]. Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rút WSSV (White