CÁC BIẾN THỂ GEN HP1125 Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Nguyệt Viện Công Nghệ Sinh học I. MỞ ĐẦU Helicobacter pylori (HP) là một trong các vi sinh vật thể hiện tính đa dạng sinh học rất cao do các quá trình đột biến, tái tổ hợp, trao đổi ADN xẩy ra trong hệ genom [1]. Trong thực tế lâm sàng, các bác sĩ thường xuyên đối mặt với các triệu chứng khác nhau của nhiễm khuẩn HP như viêm và loét dạ dày cũng như hành tá tràng dẫn đến ung thư dạ dày [2,3]. Có mối liên quan chặt chẽ giữa kiểu gen của HP với các triệu chứng bệnh lý mà chúng gây nên cho con người [4,5]. Chẳng hạn, mặc dù tất cả các chủng HP đều mang gen vacA, nhưng chỉ có 40% trong số chúng có khả năng gây không bào hoá tế bào Hela. Các nghiên cứu trên gen vacA của các chủng HP phân lập ở Mỹ cho thấy, các biến thể vacA là nguyên nhân của hiện tượng nói trên [6]. Dựa trên sự khác biệt của vùng nằm giữa gen vacA, các chủng HP có thể chia thành hai loại với kiểu gen m1 và m2, còn dựa trên sự khác biệt của vùng tín hiệu ở đầu 5’, các chủng HP có thể chia thành ba loại với các kiểu gen s1(a và b) và s2. Như thế, các chủng HP tồn tại trong tự nhiên cần phải mang các kiểu gen như được trình bầy ở bảng 1. Các khảo sát cho thấy, loại trừ m1s2 còn tất cả các kiểu gen ở bảng 1 đều được tìm thấy ở các chủng HP phân lập tại Mỹ. Bảng 1. Các kiểu gen vacA của Helicobacter pylori Các biến thể HP thể hiện các kiểu hình gen khác nhau. Ví dụ, khả năng gây không bào tế bào Hela được gắn liền với các kiểu gen của vi khuẩn, trong đó s1a>s1b và m1>m2. Trong điều kiện invivo, khả năng loét dạ dày của các bệnh nhân giảm dần khi bệnh nhân bị nhiễm các chủng HP khác nhau s1a>s1b hoặc s1a>s2. Gen HP1125 của vi khuẩn HP mã hoá cho một lipoprotein màng ngoài có phân tử lượng khoảng 20 kDa. Protein này còn được tìm thấy trong các dịch thể có nguồn gốc từ màng ngoài của vi khuẩn [7]. Nó có thể gây các đáp ứng miễn dịch ở người ở mức độ khác nhau. Do đó, trong một số trường hợp, mặc dù các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn HP, nhưng các kết quả phân tích Western hoặc Elisa lại cho kết quả âm tính giả [8]. Nguyên nhân của hiện tượng, đến nay chưa được biết. Trong bài báo này, chúng tôi thông báo kết quả nghiên cứu về gen HP1125 mã hoá cho một protein màng ngoài của các chủng HP Việt nam. Bốn mẫu đoạn gen HP1125 phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân bị loét dạ dày đã được giải mã và chúng thể hiện tính đa hình ở cả mức độ nucleotide và protein. Trong một số trường hợp, do các đột biến điểm tạo nên các stop codon bên trong gen, nên proten giả định có thể ngắn hơn dự kiến. Điều đó giải thích các kết quả âm tính giả của phân tích Western hoặc Elisa. Các kết quả nhận được mang ý nghĩa lý thuyết và thực hành. Nó nhắc nhở các bác sĩ thận trọng hơn khi kết luận về nhiễm khuẩn HP của người bệnh khi kết quả phân tích huyết học của họ âm tính. Một lần nữa, tiềm năng của ADN trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn lại được đề cập . II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các mẫu bệnh lý được lấy bằng phương pháp nội soi từ các bệnh nhân bị viêm loét dạ dày nặng vào đầu năm 2003 tại bệnh bệnh Hữu nghị. Mẫu được bảo quản ở –20 o C cho đến khi dùng. Phương pháp nghiên cứu - Tách chiết ADN và nhân gen HP1125 ADN được tách chiết từ sinh thiết dạ dày theo phương pháp đã miêu tả. Gen HP1125 được nhân bằng phương pháp PCR theo phương pháp đã miêu tả [9]. - Giải trình tự của gen HP1125 Gen HP1125 được giải trình tự trực tiếp không qua tạo dòng phân tử theo phương pháp Malt [10] Phân tích các trình tự của gen HP1125 bằng chương trình Blast trên Website. II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN NHÂN GEN HP1125 Các điều kiện để nhân gen HP1125 như nhiệt độ gắn của mồi trên ADN khuôn mẫu, thời gian tổng hợp gen ở 72oC, hàm lượng MgCl 2 … đã được tối ưu hoá để bảo đảm sản phẩm PCR có thể được tổng hợp một cách đặc thù. Hình 1 cho thấy một trong các kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 10%. Đoạn ADN được nhân là một băng duy nhất có phân tử lượng khoảng 540 cặp bazơ như dự đoán. Hình 1: Khuếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR 1. Đường chuẩn ADN 100 đôi kiềm 2. Sản phẩm PCR là một băng ADN có phân tử lượng khoảng 540 kb GIẢI TRÌNH TỰ CỦA CÁC GEN Trình tự của các đoạn ADN của gen HP1125 được giải mã trực tiếp không qua tạo dòng phân tử. Chúng được đệ trình lên quĩ gen với bốn mã số như sau: i) AY513613. ii) AY573293 iii) AY573294 iv) AY573295 CÁC BIẾN THỂ HP1125 CỦA HELICOBACTER PYLORI CỦA VIỆT NAM Trong bốn mẫu đoạn gen HP1125 nhân bằng PCR, chỉ có đoạn gen AY513613 là được giải mã hoàn toàn, còn ba trường hợp còn lại, các đoạn gen có mã số AY 573293- AY573294-AY573295 chỉ được giải mã toàn phần. Tuy nhiên, các kết quả nhận được cũng vẫn được sử dụng để nhận một số thông tin quan trọng. So sánh đoạn gen HP1125 từ bốn mẫu khác nhau được giải mã cho thấy, gen HP1125 đã thể hiện tính đa hình cao với độ tương đồng từ 92% đến 100%. Các đột biến điểm, trong đó một nucleotide có thể bị biến mất hay chuyển từ thành các nucleotide khác ( C sang T)…là nguyên nhân chính của sự khác biệt nói trên. Hình 2 minh hoạ một trong những so sánh giữa AY573293 và AY573294. Hình 2- So sánh hai đoạn gen AY573293 và AY573294 phát hiện một số đột biến điểm trong trình tự của gen. Các phân tích cho thấy hai đặc điểm quan trọng của các biến thể HP1125: 1. Các đoạn gen của biến thể HP1125 có thể mang trình tự hoàn toàn giống nhau . Hình 3 dưới đây là một ví dụ. Hai đoạn gen có mã số AY573293 và AY 513613 giống hệt nhau về trình tự, mặc dù có nguồn gốc các bệnh nhân khác nhau. Hình 3- Hai biến thể HP1125 có thể mang các trình tự như nhau. 2. Các biến thể HP1125 có thể mang các trình tự khác nhau So sánh các đoạn gen của biến thể HP1125 cho thấy chúng có thể khác nhau về trình tự ADN do đột biến điểm và chèn (hoặc thêm) của một vài nucleotide trong gen. Tuy nhiên, khung dịch mã của protein HP1125 trong một số trường hợp không vì vậy mà thay đổi. Các biến thể HP1125 thực chất là các quasi Helicobacter pylori mang các kiểu gen đột biến ở mức độ nucleotide cũng như ở mức độ protein. Nó đã được phát hiện ở các bệnh nhân Việt nam. Hai biến thể HP1125 mã số AY573294 - AY573295, do mang nhiều stop codon, nên protein của chúng có thể khác biệt và ngắn hơn mong đợi. Hình 4 là trình tự của đoạn gen AY573295 và thành phần acid amin của protein giả thiết. Rất nhiều stop codon đã được phát hiện trên đoạn gen. Protein của chúng, do vậy, có thể ngắn hơn dự đoán: [...]... vật Trypanosoma…luôn biến đổi Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa biết, liệu các biến thể HP này có thể đóng vai trò khác nhau thế nào trong quá trình gây bệnh ở người Sự khác biệt này là do có thay đổi thành phần kháng nguyên, chuyển dịch di truyền trong quần thể vi khuẩn trong đó, một kiểu gen trở nên áp đảo và các kiểu gen khác trở nên yếu thế Có một điều chắc chắn, các biến thể HP11125, với protein... thiếu hụt một vài kháng thể trong huyết thanh của người bệnh đối với một vài epitope trên protein HP1125 Trong huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm HP, các kháng thể kháng HP1125 không như nhau vì vi khuẩn trong họ mang các kiểu gen cũng như kiểu hình gen HP1125 không giống nhau Vi khuẩn Helicobacter pylori ( Việt nam) có thể tồn tại ở các dạng biến thể của gen HP1125 và có thể so sánh với các loại... đóan về sự liên quan của các biến thể HP1125 đối với sự tiến triển của bệnh nhiễm khuẩn ở từng bệnh nhân cũng được đề cập trong những nghiên cứu tiếp IV KẾT LUẬN 1- Đã nhân gen HP1125 từ bốn bệnh nhân Việt nam bị loét dạ dày nặng 2- Đã giải trình tự của sản phẩm PCR 3- Các phân tích cho thấy, các gen phân tích thực chất là các biến thể HP1125 4- Các biến thể HP1125 có thể là nguyên nhân của các kết... Trình tự ADN của gen AY573295 và thành phần của protein dự đoán Lưu ý gen HP1125 có rất nhiều stop code bên trong Protein HP1125 gây đáp ứng miễn dịch ở người Trong khi phân tích huyết thanh người bệnh nhiễm HP, Nguyễn và công sự đã phát hiện cường độ khác nhau của các tín hiệu trên màng Western {11] Do kháng nguyên là như nhau trong tất cả các trường hợp phân tích, nên điều đó chỉ có thể được giải thích... and gastric cancers ASM news 61 : 21 – 26 4 Cover, T L., Tummuru, M L R., Cao, P., Thompson, S.A and Blaser, M.J (1994) Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains J Bio Chem 269 : 10566 – 10573 5 Telford, J L et al (1994) Gene structure of the Helicobacter pylori cytotoxin and evidence of its key role in gastric diseases J Exp Med 179: 1653 – 1658... different intensity of the Western signal on the Blot using sera of Vietnamese patients and recombinant HP1125 as antigen It has not been known if the HP1125 variants could play any role in development of gastric diseases in Helicobacter pylori infected people Người thẩm định nội dung khoa học: Ts Nguyễn Hoàng Uyên ... Thi Hong Hanh (2001) The outer membrane protein HP1125 of Helicobacter pylori can be used as the antigen for Western Blot Analysis The second conference of the Vietnamese Pharmacy-medical society in 2001 pp: 119-124 9 Nguyen Thi Nguyet., Nguyen Thi Hong Hanh., Phan Thế Trung (2003) The mutations of the gene coding for the Helicobacter pylori outer membrane protein HP1125 derived from Vietnamese patients... N Thanh., Olivares, A.Z., Ha van Mao., Chey,W., Merchant,J (2001) Antigenicity of Helicobacter pylori outer membrane protein HP1125 in the Vietnamese population AGA meeting in May / 2002 SUMMARY HP1125 VARIANTS Nguyen Thi Hong Hanh and Nguyen Thi Nguyet Institute of Biotechnology Bacterium Helicobacter pylori are the causative agents of many gastric diseases such as gastritis, gastric ulcer and gastric... membrane proteins, one of which was baptized HP1125 In this research, we amplified the gene from the biopsy DNAs taken from 4 patients suffering gastric ulceration The PCR products were sequenced directly by Bi-directional solid-phase sequencing method The nucleotide sequences obtained were compared with the HP1125 genes of the Helicobacter pylori strains isolated in different geographical regions in... K và Dr David L (Trường Đại Học Tổng hợp Michigan Mỹ) vì sự giúp đỡ giải trình tự của các đoạn gen TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Hoang Tuan Anh., Nguyen Thi Hong Hanh., Le Bang Son., Nguyen Thi Thanh Loi., Nguyen Thi Nguyet., Tran Quynh Hoa., Dang Duc Trach (2002) Cloning, sequencing and analyzing the 5’end of the gen CagA of three Helicobacter pylori quasispecies derived from an isolate derived from a Vietmese . Hình 3- Hai biến thể HP1125 có thể mang các trình tự như nhau. 2. Các biến thể HP1125 có thể mang các trình tự khác nhau So sánh các đoạn gen của biến thể HP1125 cho thấy chúng có thể khác. đoạn gen AY573293 và AY573294 phát hiện một số đột biến điểm trong trình tự của gen. Các phân tích cho thấy hai đặc điểm quan trọng của các biến thể HP1125: 1. Các đoạn gen của biến thể. đoạn gen HP1125 từ bốn mẫu khác nhau được giải mã cho thấy, gen HP1125 đã thể hiện tính đa hình cao với độ tương đồng từ 92% đến 100%. Các đột biến điểm, trong đó một nucleotide có thể bị biến