ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÂM THỤY ANH THƯ ĐỀ TÀI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA BA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI VÀ QUY CÁCH SỬ DỤNG DEMECOLCINE KHI TẠO TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ THAI Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM - hướng Sinh lý động vật Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRẦN THỊ DÂN Thành phố Hồ Chí Minh – Tháng 6/2011 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã tận tình dạy dỗ chúng em trong thời gian vừa qua. Xin cám ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM và ban lãnh đạo bệnh viện Từ Dũ Tp HCM đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin gởi những lời tri ân sâu sắc nhất đến cô Trần Thị Dân và thầy Phùng Như Toàn, là người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Và cho tôi gởi những lời cám ơn chân thành đến anh Hoan, các bạn Quyên, Phú, Ngân, chị Liên, chị Oanh, chị Trang, bạn Hoàng, Trâm, anh Cường và các anh chị ở Khoa Di Truyền bệnh viện Từ Dũ, những người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Cám ơn các thầy cô đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và đóng góp ý kiến giúp cho luận văn này hoàn thiện hơn. Lâm thụy Anh Thư i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AF (amniotic fluid specific): đặc trưng của dịch ối AFP: alpha-fetoprotein bFGF(basic fibroblast growth factor): nhân tố cơ bản phát triển nguyên bào sợi DMSO: dimethyl sulphoxide DVME medium: môi trường Dulbecco-Vogt modified Eagle's E (epithelioid): dạng biểu mô F (fibroblastic): dạng nguyên bào sợi F12: môi trường Ham's F12 FBS (Fetal bovine serum): huyết thanh phôi bò FISH (Flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang FSH (human follicle-stimulating hormone ): hóc-môn kích thích nang trứng GH (growth hormon): hóc-môn sinh trưởng hCG (human chorionic gonadotropin): kích dục tố màng đệm người LH (human luteinizing hormone): hóc-môn hoàng thể hoá mFISH (multi-color flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang nhiều màu NST: nhiễm sắc thể PBS: phosphate buffered saline solution SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩn SF medium (serum-free medium): môi trường không huyết thanh α MEM: α -modified minimum essential medium ii DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ 1. Các bảng Bảng 3.1: Phân bố theo tình trạng lẫn máu mẹ của các mẫu ối Bảng 3.2: Tuổi thai của các mẫu vào thời điểm chọc ối Bảng 4.1: Tỷ lệ thành công của 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối Bảng 4.2: Số lượng các mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển Bảng 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám và tạo cụm ở các phương pháp Bảng 4.4: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (+) ở các phương pháp Bảng 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) của các mẫu ối ở các phương pháp Bảng 4.6: Thời gian nuôi cấy tế bào ối ở 3 phương pháp Bảng 4.7: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) của các mẫu ối có tuổi thai khác nhau Bảng 4.8: Phân bố (%) số mẫu theo thời gian bám và tạo cụm của các mẫu ối ở các nhóm có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau Bảng 4.9: Số cụm NST trung bình trong một quang trường của các lô thí nghiệm Bảng 4.10: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các lô thí nghiệm Bảng 4.11: Trung bình số cụm NST trong một quang trường theo liều Trang 23 23 33 38 41 42 44 46 51 56 59 64 iii lượng demecolcine xử lý mẫu trong 60 phút Bảng 4.12: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các liều lượ ng demecolcine khác nhau xử lý mẫu trong 60 phút Bảng 4.13: Trung bình số cụm NST trong một quang trường ở các lô theo thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml Bảng 4.14: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung của các lô thí nghiệm ở các mức thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml 68 68 69 70 2. Hình Hình 2.1: Hình minh họa thủ thuật chọc ối dưới sự hỗ trợ của siêu âm Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau Hình 4.1: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có nhiều tế bào đang phân chia (100x) Hình 4.2: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ dày mức độ trung bình (100x) Hình 4.3: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ che phủ mức độ dày (100x) Hình 4.4 (a), (b): Các cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ che phủ mức độ rất dày (100x) Hình 4.5: Một số mẫu thu hoạch của phương pháp 2 và phương pháp 3 Hình 4.6: Các tế bào ở giai đoạn khác nhau trong quá trình phân bào (200x) Hình 4.7: Các tế bào có bộ NST ở trạng thái khác nhau (200x) Hình 4.8: Bộ NST vẫn còn tế bào chất tạo lớp mờ bao bọc bộ NST và độ bung mức + (200x) Hình 4.9: Hai cụm NST có độ bung mức ++ và +++ (200x) 3 5 13 39 39 40 40 48 62 63 65 66 iv Hình 4.10: Bộ NST có độ bung mức +++ (A) và NST đồ tương ứng (B) (200x) 66 3. Bi ể u đ ồ Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ thành công – thất bại ở 3 phương pháp Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển Biểu đồ 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) ở các phương pháp Biểu đồ 4.4: Thời gian nuôi cấy ở 3 phương pháp Biểu đồ 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) ở 2 nhóm tuổi thai Biểu đồ 4.6: Phân bố (%) mẫu theo thời gian bám và tạo cụm ở các nhóm có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau Biểu đồ 4.7: Số cụm NST trung bình của các lô theo liều lượng demecolcine và thời gian xử lý với chất này Biểu đồ 4.8: Số cụm NST trung bình ở các lô theo theo thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25µg/ml 35 36 45 47 53 57 60 70 MỤC LỤC Phụ lục bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng, hình và biểu đồ CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tế bào ối người 2.2. Nuôi cấy tế bào 2.3. Nuôi cấy tế bào ối người 2.4. Các kỹ thuật kiểm tra số lượng và cấu trúc NST 2.5. Demecolcine 2.6. Một số các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào ối người trên thế giới và ở Việt Nam CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trang i ii 1 2 3 7 9 11 14 16 3.1. Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thực hiện 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.3. Thiết bị và hóa chất 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.5. Phương pháp toán học sử dụng trong nghiên cứu CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định phương pháp nuôi cấy hiệu quả 4.2. Bước đầu xác dịnh liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất này khi tạo tiêu bản NST thai CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.2. Đề nghị Công trình của tác giả đã công bố Tài liệu tham khảo Phụ lục 20 20 21 22 31 32 58 72 73 74 75 1 CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý nhiễm sắc thể (NST) là một trong những nguyên nhân gây dị tật bẩm sinh cho thai nhi. Những dị tật nặng sẽ gây sẩy thai, thai lưu hoặc trẻ sẽ chết sau sinh. Ví dụ như các dạng đột biến thể tam nhiễm liên quan 52% với các trường hợp sẩy thai, trong đó hội chứng Tơcnơ (Turner) (45,XO) liên quan 18% trường hợp sẩy thai, chiếm tỷ lệ cao nhất; tiếp đến là tam nhiễm cặp NST số 16 liên quan 16,4% trường hợp, các đột biến dạng chuyển đoạn không tương hỗ liên quan 3% [49]. Những dị tật nhẹ như chậm phát triển trí tuệ hay vô sinh không đe dọa tính mạng của thai nhi, nhưng thường không điều trị được, chúng tồn tại suốt cuộc đời của trẻ. Do đó tạo ra gánh nặng cho xã hội cũng như những rối loạn về tâm sinh lý khi trẻ trưởng thành. Vì vậy cần hạn chế việc sinh ra những trẻ dị tật do bệnh lý NST ngay từ trước khi sinh và đó là vai trò quan trọng của chẩn đoán tiền sản. Một trong những phương pháp chẩn đoán tiền sản khá phổ biến hiện nay là phân tích NST. Phân tích NST cùng với khám, siêu âm theo dõi, làm các xét nghiệm cần thiết đã giúp xác định được đến 99,3% trong tổng số ca dị tật được phát hiện (số liệu tại bệnh viện Từ Dũ từ tháng 6/2000 đến tháng 6/2001). Đối với các trường hợp nghi ngờ thai nhi mang các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng NST, việc phân tích NST có thể được thực hiện qua chọc rút nước ối (chọc ối) sau đó nuôi cấy tế bào nước ối thai nhi, hoặc nuôi cấy tế bào lympho của máu đứa trẻ, sau đó dùng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (kỹ thuật FISH) hay nhuộm (nhuộm thường quy hoặc nhuộm băng) khảo sát NST đồ. Đây là các xét nghiệm có ích lợi rất lớn, không những giúp chẩn đoán mà còn có thể giúp bác sĩ điều trị dự đoán khả năng bất thường đó xuất hiện lại ở những đứa con sau [2]. 2 Xét nghiệm bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang cho kết quả nhanh hơn, chỉ mất khoảng 5 ngày – 1 tuần, tuy nhiên xét nghiệm này rất đắt tiền và chỉ khảo sát được bất thường về số luợng của cặp NST số 13, 18, 21 và cặp NST giới tính. Khuynh hướng xét nghiệm sàng lọc trước sinh hiện nay ở nước ta đang nghiêng về kỹ thuật nhuộm băng khảo sát NST đồ. Kỹ thuật này cho phép khảo sát cả đột biến số lượng và cấu trúc bộ NST của thai nhi với chi phí rẻ hơn khoảng 10-20%. Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là mất thời gian khá lâu để có được kết quả, khoảng 2 – 2,5 tuần. Bên cạnh đó việc tiến hành kỹ thuật này đến nay vẫn chưa cho kết quả ổn định, tỷ lệ nuôi cấy thành công và thời gian nuôi cấy tế bào chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ, phương pháp nuôi cấy tế bào ối…Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask được dùng phổ biến hiện nay có thời gian nuôi cấy dài và tiêu hao hóa chất hơn và khi tạo tiêu bản NST chưa cho nhiều cụm NST so với các phương pháp nuôi cấy in situ. Nhằm chọn ra phương pháp nuôi cấy tế bào ối vừa hiệu quả vừa tiết kiệm, đồng thời xem xét kỹ thuật tối ưu thu hoạch tiêu bản NST chất lượng tốt khi dùng demecolcine xử lý mẫu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của ba phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu bản NST thai”. 1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU (1) Lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiệu quả (2) Xác định liều lượng demecolcine và thời gian xử lý mẫu với chất này để tạo tiêu bản NST tốt. [...]... trình nuôi cấy Địa điểm thực hiện: Phòng Di truyền bệnh viện Phụ sản Từ Dũ Tp HCM 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (1) Nội dung 1: Khảo sát hiệu quả 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối và xem xét ảnh hưởng của các điều kiện mẫu (tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ) tới hiệu quả nuôi cấy ối - Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask (phương pháp 1) - Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên slide flask (phương. .. khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, tạo xương, tạo máu, biểu hiện kiểu hình của tế bào nguồn gốc thần kinh và có khả năng tạo van tim [10], [40], [46] 2.2 NUÔI CẤY TẾ BÀO Trong phòng thí nghiệm, có 3 cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật, đó là nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy mô phát triển sơ cấp và nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào được chia thành nuôi. .. trình nuôi cấy và thu hoạch in situ tế bào ối và gai nhau, bao gồm đánh giá tác động của thể tích dịch ối, loại môi trường lên thời gian và số cụm tế bào trong nuôi cấy sơ cấp, và đánh giá ảnh hưởng của chất kiềm hãm, nhiệt độ, độ ẩm và tốc độ lưu thông khí lên chất lượng cụm NST kỳ giữa thu hoạch từ tế bào ối và gai nhau nuôi cấy sơ cấp [53], [54], [55] Pan và cộng sự (2006) khảo sát hiệu quả của phương. .. nghiên cứu của Namba và Hyodo (1980) tiến hành nuôi cấy dài ngày (nuôi cấy 7 tháng) cho thấy tế bào sợi dễ dàng cấy chuyền, và tối đa được khoảng 30 lần (nuôi cấy 150 ngày), trong khi tế bào biểu mô khó cấy chuyền và tối đa chỉ 2 đến 5 lần Sau 6 tháng nuôi cấy, hầu hết tế bào phát triển trong nuôi cấy là tế bào biểu mô Về hình thái, quan sát được 2 loại tế bào, loại Golgi và loại hình sợi Các tế bào loại... trúc của NST 2.4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ Chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ được đánh giá dựa trên các chỉ tiêu bao gồm số cụm NST kỳ giữa và chất lượng cụm NST kỳ giữa Trong đó, chất lượng cụm NST được đánh giá dựa trên độ sạch (mức độ còn sót lại của tế bào chất và màng trong cụm NST) , và độ bung của cụm NST Hliscs và cộng sự (1997) khẳng định quá trình bung của NST. .. hiệu quả của phương pháp nuôi cấy và thu hoạch in situ các tế bào ối để chẩn đoán tiền sản, kết quả phương pháp mới cho tỷ lệ nuôi cấy thành công là 100% và cụm NST tốt hơn phương pháp truyền thống [33] Sun và cộng sự (2007) nghiên cứu làm tăng tỷ lệ thành công khi nuôi cấy bằng cách thay môi trường nếu có sai sót trong khi thu nhận tế bào ối nuôi cấy và tách tế bào ối khỏi các dịch ối bất thường cùng... dịch Nhau thai Khoang ối Tế bào Vách tử cung Nuôi cấy tế bào (3) Nghiên cứu sinh hóa và NST (4) Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối (nguồn http://jon.visick.faculty.noctrl.edu/120/slides/slides17.pdf) Năm 1980, khi thực hiện các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối, người ta dựa vào hình thái chia các tế bào nuôi cấy từ dịch ối làm 2 loại, tế bào dạng biểu mô và tế bào dạng sợi... xử lý hiện băng các tế bào sau nuôi cấy cho kết quả có tính chính xác và hiệu quả chẩn đoán rất cao, vì vậy phương pháp này thường được dùng để kiểm chứng cho kết quả các phương pháp chẩn đoán tiền sản khác Trong đó phương pháp nuôi cấy chủ yếu được dùng là phương pháp 1 Tuy nhiên, do thời gian nuôi cấy tương ối dài và chất lượng tiêu bản NST chưa cao, nên việc nuôi cấy tế bào ối ở nước ta chưa phát... (phương pháp 2) - Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên giá thể lá kính đặt trong đĩa petri (phương pháp 3) (2) Nội dung 2: Bước đầu khảo sát liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất này khi tạo tiêu bản NST thai Nội dung này gồm: - Đánh giá ảnh hưởng của liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất này lên chất lượng cụm NST quan sát - Đánh giá chất lượng cụm NST khi xử lý với liều lượng demecolcine. .. loại phương tiện nuôi cấy tế bào ối mới, gọi là flaskette, giúp thu hoạch và chuẩn bị tiêu bản NST nhanh hơn so với nuôi bằng bình cấy thông thường [57] Zheng và cộng sự (2002) khi tìm kiếm phương pháp nuôi cấy làm tăng tỷ lệ thành công khi nuôi cấy tế bào ối đã tiến hành khảo sát việc nuôi cấy trên in situ flask Kết quả nhận được tỷ lệ thành công là 100%, khả năng phân tích NST đồ tốt [51] Raddatz và . Giới thiệu một số phương pháp nuôi cấy tế bào ối Có 2 phương pháp nuôi cấy tế bào ối chính, đó là nuôi cấy bằng bình cấy flask và nuôi cấy in situ. Trong đó nuôi cấy in situ gồm phương pháp nuôi. thuật tối ưu thu hoạch tiêu bản NST chất lượng tốt khi dùng demecolcine xử lý mẫu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của ba phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine. THỤY ANH THƯ ĐỀ TÀI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA BA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI VÀ QUY CÁCH SỬ DỤNG DEMECOLCINE KHI TẠO TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ THAI Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC