182 Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T- DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc (oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine synthetase và nopaline synthetase. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng cacbon và nitrogen cho vi khuẩn. 2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu quả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid hydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các tế bào không được biến nạp. 2.1.1.3. Vùng vir Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6 operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn virC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, các operon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết 183 ra từ vết thương của cây. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã tinh chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha hydroxyacetosyringon. 2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast. Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA (protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium, đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy, protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA. Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T- DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium. Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối, cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật. Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình 9.4). Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu quả cho tác nhân chuyển gene. Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium. 2.1.2. Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào. Tuy nhiên thành tế bào có thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5). Kết quả thu được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác 184 thí nghiệm. Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus. Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái sinh từ protoplast. Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi. Phôi thực vật sinh trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy. Các cây lúa và ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. 2.1.2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện 185 tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh. Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào. 2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast 186 Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gene (Hình 9.6). Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene 2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) ông ở khá nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7). Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên. Hình 9.7 vào tế bào 187 2.2. Biến nạp toàn bộ cơ thể Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên có vấn đề với phương pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác. Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau, sau khi nở hoa và tạo hạt. Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động vật. Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ. 2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới và ở Việt nam 2.3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene. Bảng 9.1. trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công. Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài. Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống cây trồng quan trọng. - Cây ngô: 1988). Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gene. Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar ) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau. Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử dụng rộng rãi. Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gene của dòng ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4- 5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi). 188 9.1. TT Loài Phương pháp biến nạp gene Thử nghiệm đồng ruộng 1 Chuối Bắn gene/Agrobacterium - 2 Luá mạch Bắn gene Kháng virus 3 Đậu tây Bắn gene - 4 Canola Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ, điều khiển sự thụ phấn 5 Sắn Bắn gene/Agrobacterium - 6 Ngô Bắn gene/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ 7 Bông Bắn gene/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ 8 Đu đủ Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus 9 Đậu phụng Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus 10 Bạch dương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, virus, chống chịu chất diệt cỏ 12 Lúa Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 13 Đậu tương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 14 Bí Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus 15 Củ cải đường Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 16 Mía Bắn gene - 17 Hướng dương Bắn gene - 18 Cà chua Agrobacterium Quả chín muộn, kháng virus 19 Lúa mì Bắn gene - - Cây lúa: đây chưa đến 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật này để biến nạp gene vào protoplast và phục hồi các : Taipei 309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống indica là khó tái sinh cây từ protoplast. Phương pháp bắn gene cho phép thực hiện biến nạp gene hiệu quả ở lúa trong các kiểu gene độc lập. Hiện 189 nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công. Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là marker chọn lọc thường dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn gene). Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene. - Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông. Các callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate ammonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp. Nói chung công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene. - Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non, các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gene. - Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene. Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gene hiệu quả vào dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gene vào các giống đậu tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh c 190 đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau. Nói chung ở các dòng đậu tương biến nạp gene có nhiều bản sao của các gene biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao gene phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên. - : Phaseolus thành công rất ít. Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene. Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp. Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus khảm màu vàng đã được phục hồi. Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện. Kỹ thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và vỏ hạt của các cây biến nạp. - Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gene cũng của giống t 1990). Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gene ngoại lai trực tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gene. 2.3.2 sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH 3 . Nitrogenease N 2 NH 3 - nif) chỉ tồn tại ở một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu (Fabaceae). Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống (Hình 9.8). 191 Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O 2 ở vùng phản ứng. Điều kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậ 2 được vùng phản ứng sạch O 2 hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như legoglobin. Đó là mộ ) đang tìm cách giải quyết. III. Kỹ thuật RFLP 1 Đại cương về kỹ thuật RFLP Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn. Khi sử dụng một hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn DNA dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp ) đều dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt. Cá thể đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác. Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau. Ngược lại khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá [...]... (Bonman và Mackill, 198 8) Một gene thể hiện tính kháng hoàn toàn ký hiệu là Pi-5(t) đã được lên bản đồ - Bệnh bạc lá: Các phân tích di truyền đã chứng minh có sự hiển di n của ít nhất 19 gene kháng bệnh bạc lá lúa (Ogawa và Khush, 198 9; Kinoshita, 199 1) Cho đến nay 7 gene kháng bệnh bạc lá đã được lập bản đồ bằng RFLP (Mc Couch và c, 199 1; Ronald và Tanskley, 199 1; Yoshimura và cs, 199 2) Người ta đã sử... của phản ứng chuỗi polymerase 3.3 Lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP Việc lập bản đồ gene cũng như việc chọn lọc giống cây trồng trên cơ sở DNA marker phát triển nhanh, nhờ sự khám phá ra phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và một dạng polymerase có tính chịu nhiệt Xây dựng bản đồ di truyền thường căn cứ trên sự xuất hiện của các biến dị có tính chất nền tảng di truyền của quần thể Phương pháp phân tích... định mức độ phong phú di truyền - Xác định độ chính xác về di truyền của con lai - Ước đoán mức độ tạp giao - Phát hiện sự du nhập gene hoang dại Nhiều gene đơn như tính bất dục đực, gene phục hồi phấn hoa, gene kháng bệnh được chuyển nhiều lần từ một vật liệu di truyền vào vật liệu khác Ở đây tính trạng trội lặn được sử dụng và yêu cầu thời gian cần thiết để chuyển nạp Các quy trình chọn lọc này cồng... hữu ích khi chúng ta áp dụng phương pháp chọn lọc với sự trợ giúp của marker (MAS: marker aided-selection) để có các giống lúa kháng rầy nâu Nghiên cứu bản đồ RFLP nhằm mục đích phân lập các QTL điều khiển tính kháng bệnh đạo ôn, đã được thực hiện tại IRRI (Wang và cs, 199 2) Nghiên cứu này đã tìm hiểu di truyền tính kháng bệnh đạo ôn trên giống Moroberekan, một giống lúa rẫy địa phương ở Tây phi có tính... cá thể 3.4 Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực vật bậc cao để xem xét các đặc tính hình thái Ví dụ, gene gây tính lùn, gene tạo ra sự thiếu lục lạp hoặc làm biến dạng lá cây Mặc dù các marker rất có ích trong nhiều nghiên cứu ứng dụng cũng như cơ bản, nhưng nó rất hạn chế trong chọn giống cây trồng Những năm gần đây, có... từ năm 192 5 Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gene, trên cùng một nhiễm sắc thể Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được, gene đó được xem là marker gene Ví dụ liên kết gene giữa lá mầm có màu tím và tính kháng rầy nâu của một vài giống lúa ở Đông bắc Ấn độ Khi giống kháng... Những tính trạng này đòi hỏi một quy trình và điều kiện môi trường đặc biệt để đánh giá Chọn lọc gián tiếp nhờ marker phân tử sẽ làm cho tiến độ chọn giống tiến hành đúng như kế hoạch, hơn nữa có thể kết hợp nhiều tính trạng chọn lọc cùng một lúc Nhờ đánh dấu được các gene, nhà chọn giống có thể theo dõi tính chất di truyền trong một cặp lai thông qua phân tích RFLP trong quần thể phân ly Ứng dụng RFLP... tử DNA Người ta có thể chọn bất kỳ đoạn nào đó với điều kiện là đã biết trình tự ở những đầu cuối Điều này rất cần thiết vì để bắt đầu PCR mỗi đoạn ngắn 199 oligonucleotide (một mồi) phải lai với một đầu sợi đơn của phân tử DNA (hình 9. 9) Đoạn oligonucleotide này là mồi cho phản ứng tổng hợp DNA và giới hạn đoạn cần khuếch đại Hình 9. 9 Phản ứng PCR khuếch đạị trình tự đích Để thực hiện phản ứng PCR... là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng chống chịu sâu bệnh hại lúa Tất cả các giống lúa đều có thể được phân chia thành nhiều kiểu gene khác nhau khi phân tích RFLP Tanksley và cs ( 199 0) nghiên cứu tại Đại học Cornell về các marker dùng trong bản đồ gene của cây lúa Có hơn 1000 RFLP marker đã được xác định trên bản đồ gene của cây lúa (Bennett, 199 4) thông qua phân tích tính chất đồng... Xa-2, Xa-3, Xa-4, Xa-5, Xa-10 và Xa-21 Gene Xa-1, Xa-5, Xa-21 là những “gene tags” (vật đánh dấu gene) rất hữu dụng trong chọn lọc một chương trình lai tạo có hiệu quả Muốn biết marker có phải là công cụ hữu ích trong chọn lọc giống lúa hay không, người ta nghiên cứu bản chất của sự kết hợp gene trong một nền tảng di truyền nào đó Các marker cung cấp ngay những thông tin về cây lúa nào mang gene gì . (Ogawa và Khush, 198 9; Kinoshita, 199 1). Cho đến nay 7 gene kháng bệnh bạc lá đã được lập bản đồ bằng RFLP (Mc Couch và c, 199 1; Ronald và Tanskley, 199 1; Yoshimura và cs, 199 2). Người ta đã. hơn, an toàn hơn, trên cơ sở của phản ứng chuỗi polymerase. 3.3. Lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP Việc lập bản đồ gene cũng như việc chọn lọc giống cây trồng trên cơ sở DNA marker phát. Hình 9. 7 vào tế bào 187 2.2. Biến nạp toàn bộ cơ thể Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật