203 thường người ta có thể khuếch đại những đoạn có độ lớn cho đến 10 kb nhưng khi độ dài càng lớn thì hiệu quả phản ứng càng thấp và càng khó khăn hơn để thu được kết quả. Có thể khuếch đại một đoạn rất dài (cho đến 40 kb) nhưng người ta phải sử dụng phương pháp đặc biệt hơn. - Kích thước của primer Đoạn mồi nên dài bao nhiêu? Nếu đoạn mồi ngắn quá thi nó sẽ gắn vào những vị trí không mong muốn, nhu vậy những đoạn không mong muốn được khuếch đại lên. Chẳng hạn, DNA tổng số của người được sử dụng với hai mồi có độ dài 8 nucleotide. Kết quả được chỉ ra ở hình 9.13. Nhiều đoạn khác nhau được khuếch đại, vì người ta tính toán trung bình cứ 65 536 bp (= 8 4 ) có một ví trí gắn cho mồi. Tổng số có khoảng 46 000 vị trí trong hệ gen người có 3 000 000 kb. Vì vậy rất khó tin là một cặp mồi tạo nên một sản phẩm PCR đồng nhất với khuôn mẫu là DNA người. Hình 9.14 Nhiệt độ có tác dụng quan trọng lên phản ứng lai giữa primer và DNA khuôn Khi sử dụng mồi có 17 nucleotide, với trình tự này thì cứ 17 179 869 184 bp có 1 vị trí gắn (= 4 17 ). Số này lớn hơn 5 lần base trong tổng số hệ gen người, vì vậy người ta chờ đợi nhiều nhất là có một vị trí gắn. Với một cặp mồi có độ dài 17 nucleotide thì có thể một sản phẩm khuếch đại duy nhất xuất hiện (Hình 9.13). 204 Độ dài của mồi ảnh hưởng đến sự gắn với DNA khuôn nhanh hay chậm, ở mồi dài thì quá trình này chậm hơn. Hiệu quả của phản ứng PCR là số lượng bản sao được tạo ra trong một thí nghiệm, sẽ giảm khi mồi dài, vì với thời gian cho phép trong chu kỳ phản ứng không xảy ra phản ứng lai đầy đủ. Trong thực tế không có mồi nào dài hơn 30 nucleotide được sử dụng. Quan trọng nhất là nhiệt độ gắn vì nó ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng. Nếu nhiệt độ cao quá, không xảy ra sự gắn kết, mồi và khuôn đứng riêng lẽ (Hình 9.14a). Nếu nhiệt độ quá thấp những thể lai không đặc hiệu bền vững, trong đó không phải tất cả các cặp base bắt cặp chính xác (Hình 9.14b). Trong trường hợp này những chú ý về độ dài của mồi không có ý nghĩa, vì từ đó chỉ xuất hiện những thể lai chính xác giữa mồi và khuôn. Khi các base bắt cặp không tương ứng thì số lượng vị trí lai với mồi tăng lên nhiều và dẫn đến nhân lên những đoạn không mong muốn. Nhiệt độ lai lý tưởng một mặt phải thấp để xảy ra phản ứng lai giữa mồi và sợi khuôn, mặt khác phải cao để không tạo nên thể lai không đặc hiệu Người ta có thể xác định nhiệt độ dựa trên nhiệt độ phân ly (T m ) của thể lai giữa mồi và khuôn. Ở nhiệt độ T m thể lai hoàn toàn phân ly, ở nhiệt độ thấp hơn T m 1-2 độ có thể tạo nên thể lai chính xác giữa mồi và khuôn, không tồn tại thể lai không đặc hiệu. Người ta biết được T m bằng thực nghiệm, nhưng phần lớn tính theo công thức: T m = (4 x G + C ) + (2 x A + T ) 0 C Trong đó G + C là số lượng nucleotide G và C trong trình tự mồi A + T là số lượng A và T. Để xác định nhiệt độ lai cho phản ứng PCR người ta tính T m cho hai mồi và để nhiệt độ thấp hơn T m 1-2 độ. Các mồi nên thiết kế để cả hai có cùng T m . Nếu không như vậy thì nhiệt độ lai đối với mồi này thì cao nhưng với mồi kia thì thấp. Cách tính Tm cho một primer 1.2. Phân tích sản phẩm PCR Sau khi tiến hành PCR, có nhiều phương pháp để phân tích sản phẩm PCR, quan trọng là các phương pháp sau - Điện di - Phân tích trình tự sản phẩm PCR - Phân tích tạo dòng sản phẩm PCR 205 Phần lớn việc kiểm tra kết quả thí nghiệm PCR thực hiện bằng cách lấy một phần sản phẩm PCR cho chạy điện di. Sau khi nhuộm màu với ethidiumbromide nhận ra một vạch. Nếu sản phẩm thu được ít thì chứng minh bằng phản ứng lai Southern blot. Nếu thiếu vạch mong đợi và xuất hiện nhiều vạch khác thì thí nghiệm phải làm lại. Trong một số trường hợp, điện di không những khẳng định được phản ứng PCR đạt kết quả hay không mà từ đó còn thu được những thông tin khác. Ví dụ có thể khẳng định, trong đoạn DNA được khuếch đại có tồn tại những vị trí cắt của enzym giới hạn hay không. Nhằm mục đích này sản phẩm PCR được xử lý bằng một enzym giới hạn và sau đó cho chạy điện di. Và người ta có thể khẳng định dựa trên độ dài của sản phẩm PCR, rằng DNA khuôn ở trong vùng khuếch đại có chứa một đoạn chèn hoặc loại bỏ đi một đoạn không (hình 9.15). Trong cả hai trường hợp đề cập đến một dạng biến đổi của phân tích RFLP ở phản ứng PCR. So với với phương pháp nguyên thuỷ nó có ưu điểm là cần rất ít nguyên liệu ban đầu. Hình 9.15 Thông qua điện di sản phẩm PCR, thu được thông tin về phân tử DNA khuôn Giếng 1. Chỉ sản phẩm PCR không cắt Giếng 2. Sản phẩm được cắt bằng một enzyme ở vị trí R Giếng 3. DNA khuôn trong vùng nhân có chứa đoạn DNA đưa vào Khi địện di không cung cấp đủ thông tin thì bước tiếp theo là xác định trình tự sản phẩm PCR. Nhằm mục đích này người ta tạo dòng sản phẩm PCR và sau đó sử dụng phương pháp xác định trình tự thông thường hoặc xác định trực tiếp trình tự sản phẩm PCR. 2. Ứng dụng PCR trong tách dòng các đoạn DNA Khi muốn có thêm những thông tin về sản phẩm PCR thì người ta gắn 206 những đoạn này vào trong một vector và nghiên cứu bằng một phương pháp tiêu chuẩn ưa thích để phân tích DNA tạo dòng. Tuy nhiên ở đây có những khó khăn. Vấn đề đầu tiên gặp phải là đầu cuối của sản phẩm PCR. Những đoạn xuất hiện bằng phản ứng PCR có đầu bằng có thể gắn đầu bằng vào một vector hoặc nối thêm linker hoặc adapter để tạo đầu dính. Hình 9.16 Khuếch đại DNA được tạo dòng trong vector Trong thực tế, Taq polymerase gắn với đầu cuối của sợi mới tạo thành thường ở một nucleotide bổ sung thêm, phần lớn là một adenosin. Sản phẩm PCR mạch kép không có đầu dính, mà ở mỗi đầu cuối 3’ có một nucleotide (Hình 9.17). Người ta có thể cắt ra nucleotide bổ sung này bằng một exonuclease và tạo ra những phân tử có đầu bằng. Phương pháp này hạn chế sự cắt tiếp tục của exonuclease và những đầu cuối bị ảnh hưởng. Hình 9.17 Polynucleotide được tổng hợp từ Taq polymerase thường mang đầu cuối 3’ một adenosine. Để giải quyết khó khăn này người ta sử dụng một vector tạo dòng đặc biệt hơn với nucleotide T đứng đối diện, có thể được gắn kết với DNA được khuếch đại (Hình 9.18). Để tạo ra một vector thông thường người ta 207 tạo ra một vector với những đầu cuối cắt bằng enzyme giới hạn và sau đó xử lý nó với Taq polymerase và chỉ bổ sung thêm ATP. Vì hỗn hợp này không chứa mồi, nên Taq polymerase chỉ gắn 1 nucleotide T vào đầu bằng của vector đã được cắt ra. Một vector có đầu cuối những T như vậy được gắn với sản phẩm PCR. Hình 9.18. Tạo dòng sản phẩm PCR trong vector với nucleotide ở đầu cuối Phương pháp thứ hai được sử dụng nhiều hơn là thiết kế mồi có chứa vị trí cắt giới hạn. Sau phản ứng PCR người ta xử lý những phân tử mới tạo ra bằng một enzyme giới hạn. DNA trong trình tự mồi được cắt và ở đây xuất hiện những đầu dính, có thể đưa chúng có hiệu quả vào một vector tạo dòng bình thường (Hình 9.19). Phương pháp này không hạn chế trong mọi trường hợp, trong đó các đoạn mồi trùm lên một vị trí cắt giới hạn đã có trong DNA khuôn. Người ta có thể gắn những trình tự nhận biết của enzyme như là những đoạn ngắn vào đầu 5’ của mồi (Hinh 9.20). Những đoạn này không lai với khuôn nhưng được sao chép trong phản ứng PCR, như vậy sản phẩm PCR mang ở mỗi đầu cuối một vị trí cắt của enzyme giới hạn. Những khó khăn do sự khiếm khuyết của Taq polymerase: Tất cả những DNA polymerase có lỗi trong khi tổng hợp, nghĩa là thỉnh thoảng nó có thể gắn một nucleotide sai vào sợi DNA đang tổng hợp. Tuy nhiên phần lớn DNA-polymerase sửa chữa được những lỗi này, trong đó nó 208 quay lại để cắt nucleotide đã được gắn vào sai và gắn vào nucleotide đúng. Đặc tính có “chức năng sửa chữa” phụ thuộc vào hoạt tính của exonuclease theo hướng 3’ 5’ của polymerase. Hình 9.19. Tạo sản phẩm PCR có đầu dính nhờ sử dụng primer, trong đó có vị trí enzyme cắt giới hạn Hình 9.20. Primer PCR với vị trí cắt ở đầu 5’ được kéo dài Taq polymerase thiếu chức năng sửa chữa này, nghĩa là chúng không thể sửa được lỗi. DNA được tổng hợp từ enzyme này không phải luôn luôn là bản sao chính xác của phân tử khuôn. Lỗi gặp phải theo ước đoán là khoảng 1 nucleotide trong 9000, thể hiện lỗi ít, nhưng sau 30 chu kỳ phản ứng thì lỗi lên đến 300 bp. Vì ở phản ứng PCR nhiều bản sao thường xuyên xuất hiện từ bản sao nên lỗi do PCR-polymerase gây ra tăng dần và những bản sao xuất hiện về cuối PCR mang những nucleotide được gắn vào sai từ những chu kỳ trước là những lỗi mới thêm vào trong những chu kỳ tổng hợp cuối. 209 Hình 9.21 Tần suất lỗi cao của Taq polymerase khi tạo dòng sản phẩm PCR Trong nhiều lĩnh vực ứng dụng những lỗi tổng hợp này không phải là vấn đề lớn. Đặc biệt hơn sự phân tích trình tự trực tiếp sản phẩm PCR cung cấp những trình tự chính xác mặc dù có lỗi do Taq polymerase gây ra, vì theo phân bố thống kê những base được gắn sai nhưng nhiều phân tử khác xuất hiện trên mỗi một đoạn với một lỗi ở một vị trí nhất định có trình tự ở vị trí này là chính xác. Trong trường hợp này sự mắc lỗi là không có ý nghĩa. Mặt khác sẽ như thế nào nếu sản phẩm PCR được tạo dòng. Mỗi một dòng chứa nhiều bản sao của một đoạn duy nhất được khuếch đại trong phản ứng PCR và DNA tạo dòng không nhất thiết có cùng trình tự như phân tử khuôn mà người ta cho vào để khuếch đại (Hình 9.21). Điều này dẫn đến sự không chắc chắn ở tất cả các thí nghiệm với sản phẩm PCR tạo dòng. Vì vậy nếu có thể thì nghiên cứu DNA được khuếch đại trực tiếp và không tạo dòng. 210 PCR vào lập bản đồ di truyền PCR (random amplified polymorphic DNA analysis-RAPD). Trong phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với các primer chọ . triển như đa hình các đoạn cắt giới hạn (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay còn gọi là sự lặp lại các đoạn nucleotid (amplified fragment lenght polymorphism, AFLP). Các kỹ thuật này được xây dựng trên cơ sở PCR có triển vọng rất lớn trong nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), địn . 4. Nguyên tắc và cơ sở di truyền của phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS-marker aided-selection) dựa vào PCR Một chỉ thị di truyền cần có hai yêu cầu cơ bản: thứ nhất là phải có sự khác biệt giữa cơ thể bố và cơ thể mẹ và thứ hai là nó phải được truyền lại chính xác cho thể hệ sau. Người ta phân ra các kiểu chỉ thị di truyền sau: 4.1. Chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, một tính trạng nào đó do một locus kiểm soát mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng bởi tác động của môi trường, có thể dùng làm một chỉ thị hình thái cho quá trình chọn lọc. 4.2. Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử là đặc điểm ở khía cạnh hóa học hay cấu trúc phân tử được di truyền lại cho thế hệ sau giống các nhân tố di truyền Mendel nhưng lại có thể định lượng được. Có hai loại chỉ thị phân tử cơ bản: Chỉ thị isozyme: isozyme là những dạng enzyme có cùng một phản ứng hóa học như nhau nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Về mặt di truyền có thể chia isozyme làm hai dạng: isozyme đơn gene và isozyme đa gene. Chỉ thị phân tử DNA: Chỉ thị phân tử DNA rất phong phú, do sự đa dạng của DNA, tính ổn định và sự không lệ thuộc của chúng vào các yếu tố môi trường. Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài. Chúng cũng có thể được dùng để chọn tổ hợp lai. Kiểu chỉ thị này được sử dụng rất có hiệu quả để lập bản đồ phân tử cho những cây 211 trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hay sinh sản vô tính khó khăn. Chỉ thị phân tử được chia ra làm hai nhóm lớn: - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP - Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR. Cho đến nay có rất nhiều chỉ thị phân tử được phát triển dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random amplified polymorphism DNA), SSR (Simple sequence repeats), STS (sequence tagged site) … Chọn lọc nhờ chỉ thị dựa vào PCR Tính biến dị di truyền giữa các giống trong một loài cây có thể được phát hiện do sự sai khác về chiều dài của đoạn DNA đích được nhân bản nhờ PCR khi sử dụng cùng một cặp primer. Đó là do sự thay thế base ở các điểm liên kết primer hoặc do sắp xếp lại trật tự DNA trong vùng chứa các điểm đó. Những sự thay đổi như thế được phản ảnh ở tính đa dạng về chiều dài của các đoạn DNA được nhân bản (amplicon length polymorphism) – ALP. Các primer được dùng trong phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị dựa trên PCR thường căn cứ vào các điểm có trật tự nucleotide đã được xác định, gọi là chỉ thị điểm trật tự được đánh dấu - STS (sequence tagged site). Chỉ thị STS đang được sử dụng rất phổ biến trong lập bản đồ geneome. STS là một đoạn DNA ngắn khoảng 60-1000 bp và có thể phát hiện được bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide biết trước của DNA trong geneome. Hai đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide đã biết giúp ta xác định được vùng DNA cần tìm. Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR. Một lượng lớn STS có thể được tạo ra nhờ sử dụng kỹ thuật RFLP và các dòng cDNA làm mẫu dò. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là mốc trong genome. Dựa trên các kết quả phân tích về chỉ thị STS, RAPD, có thể xây dựng được các bản đồ di truyền liên kết ở một giống cây trồng nào đó. Nhờ vậy việc tìm kiếm các gene kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành một cách dễ dàng. - Chỉ thị AFLP cho phép phát hiện được tính đa dạng về chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc. Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng của cây trồng như lúa, lạc, … - Chỉ thị SSR: SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide đơn giản nào đó. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số đơn vị lặp lại mà độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di. Chỉ thị SSR đã được dùng để chọn lọc tính kháng bệnh khảm do virus của cây đậu tương, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở lúa hoặc xác lập mối quan hệ thân thuộc 212 giữa các giống cây trồng ở cà chua, lúa, đậu tương, mía, … - Chỉ thị RAPD cho phép phát hiện tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một mồi đơn (thường chứa 10- 12 nucleotide, tối thiểu là 4 bp) chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Chỉ thị RADP thường được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể phục vụ cho công tác lai tạo hoặc phân loại. Chúng cũng được sử dụng để xác định những gene kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng như tính trạng chất lượng, tính kháng virus, … V. Một số kỹ thuật khác và ứng dụng của chúng trong chọn giống thực vật trên thế giới và ở Việt Nam Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gene ở thực vật bậc cao đã có rất nhiều tiến bộ. Hiện nay các phòng thí nghiệm công nghệ gene đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loại cây trồng nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử. Trong một vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô và bông) các phương pháp biến nạp gene bị giới hạn bởi genotype. Một số các cây trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển ít được chú ý. . Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp gene, một vài vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại, nhưng chúng đang dần dần được giải quyết. Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác, như là phát hiện và tạo dòng các gene mang các tính trạng đa gene (multigeneic traits). Một điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại. Hiện nay công nghệ biến nạp gene đang được quan tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của các cơ quan quốc tế như là chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều là cần thiết xác định phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công nghệ biến nạp gene mang lại đến các nước đang phát triển. 1983. Điều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho các nhà tạo giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới cho công nghiệp và người tiêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển. [...]... Spring Habor Laboratory USA 3 Newton CR and Graham A 1994 PCR BIOS Scientific Publishers Limited 4 Lê Duy Thành 2000 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật NXB Khoa học và Kỹ thuật 5 Wiser MF 2002 Lecture notes for method in cell Spring TRANG WEB : http://www.appliedplantsciences.umn.edu/Plant_Breeding_Molec ular_Genetics.html http://www.irri.org/irrc/hybridrice/Marker.asp http://www.plantsciences.ucdavis.edu/plantsciences/... kỹ thuật chuyển gene 2 Trình bày các phương pháp chuyển gene vào cây trồng 3 Ứng dụng của kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật 4 PCR là gì? Các giai đoạn của phản ứng PCR 5 Ứng dụng PCR trong tách dòng các đoạn DNA Tài liệu tham khảo 1 Nguyễn Hoàng Lộc 1998 Bài giảng Công nghệ gene thực vật Đại học Khoa học Huế 2 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989) Molecular Cloning (A laboratory manual) Cold... http://www.sciencedaily.com/articles/g/genetically_modified_foo d.htm http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html http://www3.interscience.wiley.com/cgibin/abstract/112506342/ABSTRACT (Giải mã Bộ gen cây lúa) http://www.aphis.usda_gov/biotechnology/ http://www.agbioworld.org TỪ KHOÁ : 214 Kỹ thuật di truyền : Genetic engineering Gen chỉ thị : Marker gene / Chỉ thị phân tử : Molecular maker (phương pháp) Vi tiêm : Microinjection Công nghệ tế bào thực. .. (phương pháp) Vi tiêm : Microinjection Công nghệ tế bào thực vật : Plant cell biotechnology Đa hình độ dài phân đoạn cắt hạn chế : Restriction fragment length polymorphism (RFLP) - Phản ứng dây chuyền của polymerase : Polymerase chain reaction (PCR) - Công nghệ sinh học nông nghiệp : Agricultural Biotechnology - Thực vật biến đổi gene : Genetically modified organisms (GMO plants) - . này được xây dựng trên cơ sở PCR có triển vọng rất lớn trong nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), địn . 4. Nguyên tắc và cơ sở di truyền của phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS-marker. Graham A. 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers Limited. 4. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 5. Wiser MF. 2002. Lecture notes for method in. thái cho quá trình chọn lọc. 4.2. Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử là đặc điểm ở khía cạnh hóa học hay cấu trúc phân tử được di truyền lại cho thế hệ sau giống các nhân tố di truyền Mendel nhưng