B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI === === PHM TH THU THY ĐáNH GIá CHấT LƯợNG TINH TRùNG SAU BảO QUảN LạNH sâu ở NHữNG MẫU NHƯợC TINH Đã ĐƯợC LọC RửA LUN VN THC S Y HC H NI - 2011 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI PHM TH THU THY ĐáNH GIá CHấT LƯợNG TINH TRùNG SAU BảO QUảN LạNH sâu ở NHữNG MẫU NHƯợC TINH Đã ĐƯợC LọC RửA Chuyờn ngnh : Mụ hc - Phụi thai hc Mó s : 60.72.01 LUN VN THC S Y HC Ngi hng dn khoa hc: TS. Nguyn Khang Sn H NI - 2011 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bảo quản lạnh mô và tế bào là kỹ thuật bảo quản mô và tế bào sống ở nhiệt độ cực thấp. Quá trình sống đòi hỏi sự vận động của các phân tử trong môi trường nước. Bảo quản lạnh làm môi trường nước ở trong và ngoài tế bào biến đổi thành thể rắn, quá trình đó làm ngừng chuyển động các phân tử và các quá trình sinh học trong tế bào. Bảo quản lạnh được coi là thành công nếu tế bào trở lại hoạt động sống bình thường, không bị tổn thương về cấu trúc cũng như chức năng khi đưa về 37 o C [6], [23]. Bảo quản lạnh tinh trùng là một kỹ thuật quan trọng thường được sử dụng trong hỗ trợ sinh sản. Kỹ thuật này được thực hành rộng rãi để lưu trữ tinh trùng trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo hay thụ tinh trong ống nghiệm [40]. Chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng tinh trùng trước bảo quản lạnh, quy trình bảo quản, môi trường bảo quản, nhiệt độ bảo quản. Sau bảo quản lạnh các mẫu tinh trùng bình thường, nhiều nghiên cứu cho thấy các chỉ số về mật độ, độ di động, khả năng sống của tinh trùng đều giảm rõ rệt so với trước khi bảo quản [13],[27],[67]. Đánh giá ảnh hưởng của quá trình bảo quản lạnh lên chất lượng tinh trùng ở mẫu tinh dịch bất thường là vấn đề gần đây đang được quan tâm [19],[24],[50]. Quá trình này góp phần bảo quản, lưu giữ các tinh trùng được coi là quý hiếm đối với những bệnh nhân nam bị vô sinh do bất thường tinh trùng. Ngày nay, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản mà hy vọng có con của các bệnh nhân này hoàn toàn có thể thực hiện được. Quá trình lọc rửa tinh trùng trước khi bảo quản giúp loại bỏ tinh tương, các tinh trùng chết, tinh trùng bất thường, các mảnh vỡ, vi khuẩn, bạch cầu, các gốc oxy hoạt động… Việc lọc rửa tinh trùng còn loại bỏ hầu hết HIV, 2 HCV, CMV, HPV, hạn chế sự lây nhiễm chéo trong quá trình bảo quản lạnh trong nitơ lỏng [18],[24],[30]. Nguyễn Phương Thảo Tiên (2007) khi tiến hành nghiên cứu trên những mẫu tinh dịch bình thường, tác giả thấy không có sự khác biệt về các chỉ số chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu giữa các mẫu tinh trùng đã được lọc rửa và những mẫu tinh trùng không được lọc rửa [13]. Hiệu quả của việc lọc rửa tinh trùng trước khi bảo quản lạnh đối với các mẫu tinh dịch bất thường như thế nào. Sau quá trình bảo quản lạnh các mẫu tinh trùng đã được lọc rửa có thể thu hồi được những tinh trùng tốt để chuẩn bị cho hỗ trợ sinh sản hay không. Hiện chưa có nhiều nghiên cứu về việc bảo quản lạnh những mẫu tinh trùng bất thường của người nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhƣợc tinh đã đƣợc lọc rửa” với mục tiêu: 1- Đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhược tinh đã được lọc rửa. 2 - Xác định ảnh hưởng của việc lọc rửa đối với các mẫu nhược tinh được bảo quản lạnh. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VÔ SINH NAM. Vô sinh là một vấn đề của toàn xã hội. Vô sinh hiện nay có chiều hướng ngày càng gia tăng. Theo những số liệu điều tra dân số trong những năm gần đây, có khoảng 7-10% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh [8],[11]. Trên thế giới vô sinh cũng chiếm một tỷ lệ tương tự, vào khoảng 10- 15% [54]. Có nhiều nguyên nhân gây ra tình trạng vô sinh, trong đó nguyên nhân do nam và do nữ là ngang nhau [12]. Trong số các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới, có đến 90% nguyên nhân do bất thường tinh trùng [11]. Những bất thường tinh trùng thường gặp là: số lượng tinh trùng ít (thiểu tinh), tinh trùng di động kém (nhược tinh), tinh trùng dị dạng (quái tinh) và không có tinh trùng (vô tinh) [8]. R. Gurevich (2010) cho biết tỉ lệ nam giới bị vô sinh do không có tinh trùng chiếm 10-15% và tỉ lệ những người không có tinh trùng chiếm khoảng 1% dân số nói chung [54]. Tác giả Nguyễn Xuân Quý (2004) khi nghiên cứu trên 396 cặp vợ chồng điều trị vô sinh cho kết quả: vô tinh chiếm tỷ lệ 10,1%, thiểu tinh chiếm 27,3%, tỷ lệ nhược tinh là 71,9 % và quái tinh chiếm tỷ lệ 74,2 % [11]. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Poongothai J. (2009) có đến >50% các trường hợp vô sinh nam không rõ nguyên nhân [53]. Số lượng và độ di động của tinh trùng là những yếu tố quan trọng giúp cho tinh trùng có khả năng thụ tinh. Theo WHO 1999, một mẫu tinh dịch bình 4 thường có ít nhất 50% tinh trùng di động tiến tới. Mẫu tinh dịch được coi là nhược tinh khi tỷ lệ tinh trùng di động trong mẫu ít hơn 50% [68]. Nhược tinh thường kết hợp với thiểu tinh, chỉ một số ít người có số lượng tinh trùng bình thường nhưng khả năng di động của tinh trùng kém [46]. Cơ chế sinh bệnh học của bệnh nhược tinh vẫn còn chưa rõ ràng, tuy nhiên các tác giả nghiên cứu cũng đề cập đến các yếu tố nguy cơ của bệnh như: nhiễm trùng, phẫu thuật, các chất kích thích, ảnh hưởng của các chất gây ô nhiễm môi trường, hóa chất, bức xạ…Một trong các cách mà các chất gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng là chúng tác động vào cơ thể, kích thích cơ thể sản xuất các gốc tự do trong quá trình chuyển hóa tế bào. Trong khi cơ thể con người tạo ra chất chống oxy hóa để bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do thì các chất gây ô nhiễm môi trường và sự gia tăng các gốc tự do đã phá vỡ cân bằng mong manh đó và gây ra những bất thường về mật độ, độ di động và hình dạng của tinh trùng [36]. Zhou QZ và cs (2009) cũng đã tìm thấy một số gen (tektin-2, DNAI1, DNAH5, ) và các protein (ACTB, ANXA5, PRM1, ) có liên quan đến bệnh nhược tinh [70]. Vô sinh nam thường được chẩn đoán bằng xét nghiệm phân tích tinh dịch. Điều trị vô sinh nam hiện nay chủ yếu nhằm nâng cao chất lượng tinh trùng, do đó làm tăng khả năng chọn lọc được những tinh trùng tốt để chuẩn bị cho HTSS. Năm 1995, kỹ thuật chọc hút tinh trùng từ mào tinh qua da và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Percutanous Epidemal Sperm Aspiration: PESA, Intracytoplasmic sperm injection: ICSI), kỹ thuật phân lập tinh trùng từ tinh hoàn những trường hợp giảm sinh tinh tại tinh hoàn và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Testicular Sperm Aspiration: TESA/ICSI) được báo cáo thành công. Sự thành công của các kỹ thuật này đã mở ra một hướng phát triển mới trong điều trị vô sinh nam [16]. 5 1.2. NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN LẠNH SÂU TINH TRÙNG NGƢỜI. 1.2.1. Lịch sử phát triển của phƣơng pháp bảo quản lạnh sâu tinh trùng ngƣời. * Trên thế giới Ngay từ năm 1776, Spallanzani lần đầu tiên đã dùng nhiệt độ lạnh sâu - 78 o C và không sử dụng môi trường để bảo quản tinh trùng. Đến năm 1937, Bernstein và Petropavloski đã tiến hành bảo quản thành công các tinh trùng của bò, cừu, ngựa, heo rừng và thỏ ở nhiệt độ -21 o C. Nghiên cứu của Jahnel (1938) và Parkes (1945) đã công bố phương pháp làm lạnh tinh trùng người [dẫn từ 67]. Hoagland và Pincus (1942) đã mô tả quá trình làm lạnh nhanh tinh trùng người và thỏ bằng việc sử dụng vòng làm lạnh đối với các mẫu nhỏ. Các tác giả thu được kết quả lên đến 40% tinh trùng còn sống sót sau phương pháp bảo quản này [dẫn từ 67]. Đến năm 1949, Polge và cộng sự đã sử dụng glycerol làm môi trường bảo quản lạnh. Sử dụng glycerol trong bảo quản lạnh tinh trùng đã đem lại kết quả khả quan. Nghiên cứu của Polge và cộng sự được coi là dấu mốc quan trọng của bảo quản lạnh mẫu sinh vật hiện đại. Năm 1953, đứa trẻ đầu tiên đã ra đời từ tinh trùng bảo quản lạnh. Trong những năm tiếp theo, phương pháp này được áp dụng rộng rãi cùng với các kỹ thuật (hạ nhiệt độ, đóng gói, sử dụng môi trường bảo quản) ngày càng tiến bộ. Smirnov (1949) đã bảo quản lạnh thành công tinh trùng thỏ trong nitơ lỏng. Đến năm 1963-1964, phương pháp làm lạnh tinh trùng trong nitơ lỏng chính thức ra đời. Sherman (1962) đã bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -196 o C và chỉ 2 năm sau đó 4 đứa trẻ đã ra đời bằng việc sử dụng tinh trùng đông lạnh -196 o C [59]. Lizuka và cộng sự (1968) đã sử dụng môi trường có bột 6 lòng đỏ trứng gà để bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -196 o C và đã có nhiều trẻ em ra đời bằng phương pháp này. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu mới về kỹ thuật bảo quản tinh trùng người như: phương pháp đông tinh nhanh sử dụng cọng rạ tự kéo [31],[41], bảo quản tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa không cần chất bảo quản [67]… bước đầu đem lại các kết quả khả quan. Ngày nay, nhờ sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ, nhiều phương pháp hỗ trợ sinh sản phát triển như: thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh trùng của người cho (artificial inseminatiom of donor semen: AID) hoặc của chồng (artificial inseminatiom of husband semen: AIH), thụ tinh trong ống nghiệm và chuyển phôi (IVF/ET), tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI) nên việc bảo quản tinh trùng phục vụ cho các phương pháp hỗ trợ sinh sản càng cần được mở rộng. Sự ra đời của các ngân hàng tinh trùng từ những năm 1970 ở hầu khắp các nước trên thế giới đã góp phần đáp ứng được nhu cầu này. * Tại Việt Nam Bệnh viện phụ sản Từ Dũ đã thực hiện thành công bảo quản lạnh tinh trùng người vào năm 1995, đặt tiền đề cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện thành công lần đầu tiên vào năm 1997 [9]. Cho đến nay, nhiều cơ sở như: Bệnh viện Từ Dũ, Học viện Quân y, Bộ môn Mô Phôi học - Trường Đại học Y Hà Nội,… đã có những nghiên cứu được công bố về lĩnh vực này. Gần đây, kỹ thuật bảo quản tinh trùng phát triển khá nhanh cùng với sự ra đời của các ngân hàng tinh trùng trong nước đã đáp ứng được nhu cầu điều trị của số lượng lớn bệnh nhân. Phương pháp bảo quản tinh trùng được áp dụng phổ biến ở Việt Nam hiện nay là bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ lạnh sâu -196 o C, trong nitơ lỏng, quy trình hạ nhiệt độ từ từ, có sử dụng môi trường bảo quản [14]. 7 1.2.2. Những nghiên cứu về quy trình bảo quản lạnh sâu tinh trùng ngƣời. Nghiên cứu về quy trình bảo quản lạnh sâu tinh trùng người đã được nhiều tác giả đề cập và đưa ra những quy trình bảo quản khác nhau. Nhìn chung, quy trình bảo quản tinh trùng người gồm các bước sau: - Chọn mẫu và xét nghiệm tinh dịch. - Cân bằng với môi trường bảo quản lạnh. - Đóng gói. - Hạ nhiệt độ. - Lưu trữ trong nitơ lỏng. - Tan đông. 1.2.2.1. Chọn mẫu và xét nghiệm tinh dịch Tùy theo mục tiêu nghiên cứu mà mẫu tinh dịch được chọn để xét nghiệm sẽ có các tiêu chuẩn khác nhau. Cách đánh giá mẫu tinh dịch đa số các tác giả áp dụng theo tiêu chuẩn của WHO 1999. Hiện nay, Bộ môn Mô- Phôi, Đại học Y Hà Nội và nhiều cơ sở khác cũng đã áp dụng tiêu chuẩn này trong xét nghiệm tinh dịch đồ. 1.2.2.2. Cân bằng với môi trường bảo quản lạnh Nhiều tác giả đã sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau để bảo quản tinh trùng người. Công bố về hiệu quả của các môi trường trong bảo quản lạnh tinh trùng cũng rất khác nhau. Ban đầu, các tác giả sử dụng glycerol đơn thuần để làm môi trường bảo quản lạnh. Từ năm 1937, Bernstein và Petropavlovski đã sử dụng glycerol 0,5-3M để bảo quản lạnh các tinh trùng của động vật. Các tác giả đã thu được những kết quả tốt nhất ở nồng độ glycerol 0,5-2M. Về sau, nhiều tác giả đã bổ sung thêm các chất khác cùng với glycerol để tăng hiệu quả bảo quản lạnh như: bột lòng đỏ trứng gà, các acid amin…[31],[59]. 8 Năm 1999, J.K Sherman khi đánh giá hiệu quả của hai môi trường bảo quản lạnh đã đưa ra kết luận: tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản không có sự khác biệt khi sử dụng môi trường bảo quản là glycerol-egg yolk hay glycerol đơn thuần [59]. Năm 2000, tác giả Hallak J và cộng sự đã nghiên cứu so sánh khi sử dụng môi trường bảo quản là TEST-Yolk và glycerol ở các khoảng thời gian bảo quản khác nhau. Kết quả cho thấy: tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh trùng hình thái bình thường ở nhóm TEST-Yolk cao hơn so với nhóm glycerol (p<0,05). Từ các nghiên cứu trên, các tác giả đều khuyến cáo TEST-Yolk là môi trường được lựa chọn đầu tiên để bảo quản lạnh tinh trùng người. Ở Việt Nam, theo Trịnh Sinh Tiên (2002): quy trình bảo quản tinh trùng người dùng môi trường GEYC và môi trường Sperm Freeze có hiệu quả với chỉ số sống sót sau bảo quản lạnh (Cryosurvival Factor: CSF) ≥ 50%, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với bảo quản ở môi trường glycerol đơn thuần [14]. 1.2.2.3. Đóng gói Các mẫu tinh dịch sau khi được làm cân bằng với môi trường bảo quản lạnh được nạp vào các dụng cụ đóng gói chuyên dụng. Có hai hình thức đóng gói hay được sử dụng là cọng rạ (straw) bằng nhựa 0,25 ml, 0,5 ml hoặc tuýp chịu lạnh (cryovial) 2ml. Hiện chưa có nhiều nghiên cứu về hiệu quả của hai hình thức đóng gói này. Theo Marcelo Borges Cavalcante (2006): sử dụng tuýp chịu lạnh mang lại kết quả tốt hơn so với sử dụng cọng rạ [47]. Ghasem Saki và cộng sự còn đề xuất sử dụng cọng rạ tự kéo để bảo quản một lượng nhỏ tinh trùng người cho kết quả khả quan hơn việc sử dụng cọng rạ thông thường [31]. [...]... có thai sau khi làm IUI ở mẫu thiểu tinh và nhược tinh đã được lọc rửa [50] Việc lọc rửa đã giúp chọn lọc được những tinh trùng có chất lượng tốt để bảo quản, do đó làm tăng chất lượng tinh trùng sau bảo quản Mục tiêu bảo quản tinh trùng lạnh sâu là tinh trùng sau bảo quản có chất lượng cao nhất Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Ngân hàng Mô Hoa Kỳ: Tỷ lệ tinh trùng di động sau bảo quản phải đạt được ≥ 50%... DNA sau rã đông ở mẫu tinh trùng tươi cũng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với mẫu tinh trùng đã được lọc rửa [27] Như vậy, tinh trùng tươi đông lạnh dường như đề kháng tốt hơn với hiện tượng shock lạnh so với tinh trùng đã được lọc rửa và chất lượng tinh trùng sau rã đông phụ thuộc chủ yếu vào chất lượng mẫu tinh trùng trước khi bảo quản Trong nghiên cứu Đánh giá khả năng sống của tinh trùng sau rã... nước có trong tinh trùng Chất bảo vệ” sẽ ngăn ngừa hình thành tinh thể đá, nên tinh trùng sẽ được an toàn trong quá trình trữ lạnh 17 1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BẢO QUẢN LẠNH SÂU CÁC MẪU TINH TRÙNG ĐÃ ĐƢỢC LỌC RỬA 1.3.1 Khái niệm về lọc rửa tinh trùng Lọc rửa tinh trùng là phương pháp tách tinh trùng khỏi tinh tương, được sử dụng nhiều trong hỗ trợ sinh sản Các phương pháp lọc rửa tinh trùng ban đầu... sau đó được bảo quản lạnh 2.3.1.3 Kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng: Cả mẫu tinh dịch tươi không lọc rửa và mẫu tinh dịch đã lọc rửa đều được bảo quản lạnh theo một quy trình chung Mỗi một phần (1,5ml) tinh dịch tươi hoặc tinh dịch đã được lọc rửa được chia thành 3 phần bằng nhau để tiến hành nghiên cứu ở 3 thời điểm khác nhau Các bước tiến hành gồm: - Cho môi trƣờng bảo quản lạnh vào tinh dịch: Sử... này được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn của WHO (1999) và đáp ứng được tiêu chuẩn chọn mẫu của nghiên cứu, được bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ -196oC, trong nitơ lỏng theo hai phương pháp: bảo quản mẫu tươi không lọc rửa và bảo quản mẫu sau khi lọc rửa Các mẫu tinh dịch được đánh giá sau các khoảng thời gian bảo quản : 1 ngày, 10 ngày và 30 ngày 3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU TINH DỊCH NGHIÊN CỨU 3.1.1 Phân bố mẫu. .. thụ tinh là cần thiết Trong nghiên cứu “So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh trong hơi nitơ và trong nitơ lỏng ở mẫu tinh trùng tươi và mẫu tinh trùng đã lọc rửa , Saritha K.R (2001) thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ sống của tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng di động sau bảo quản lạnh khi trữ lạnh trong hơi nitơ 21 lỏng hoặc trong nitơ lỏng (p>0,05) Tuy nhiên, các tỷ lệ này giảm đáng kể sau bảo. .. lệ tinh trùng di động trước bảo quản [59] Ở Việt Nam, trong những năm gần đây bảo quản tinh trùng người là lĩnh vực rất phát triển Tác giả Hồ Mạnh Tường (2000) đã đánh giá độ di động sau bảo quản so với trước bảo quản bằng chỉ số CSF (Cryosurvival Factor): 15 CSF = % tinh trùng di động sau rã đông : % tinh trùng di động trước trữ lạnh x 100% Tác giả nhận thấy những mẫu tinh dịch có mật độ tinh trùng. .. tinh trùng sống, chết - Tỉ lệ tinh trùng hình thái bình thường, bất thường đầu và cổ 31 - So sánh các chỉ số trước và sau bảo quản: + Chỉ số CSF di động = % tinh trùng di động sau bảo quản x 100% % tinh trùng di động trước bảo quản + Chỉ số CSF di động tiến tới = + Tỷ lệ tinh trùng sống = % tinh trùng di động tiến tới sau bảo quản x 100% % tinh trùng di động tiến tới trước bảo quản % tinh trùng sống sau. .. đông ở các mẫu thiểu tinh và mẫu bình thường được lọc rửa bằng hai phương pháp bơi lên và thang nồng độ Percoll trước khi bảo quản lạnh , Counsel M (2004) đã kết luận: lọc rửa bằng phương pháp bơi lên đã làm tăng khả năng sống của tinh trùng sau rã đông ở cả mẫu bình thường và mẫu thiểu tinh (p . “Đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhƣợc tinh đã đƣợc lọc rửa với mục tiêu: 1- Đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhược tinh đã. trên những mẫu tinh dịch bình thường, tác giả thấy không có sự khác biệt về các chỉ số chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu giữa các mẫu tinh trùng đã được lọc rửa và những mẫu tinh trùng. thiện được số lượng tinh trùng di động tiến tới và tỷ lệ có thai sau khi làm IUI ở mẫu thiểu tinh và nhược tinh đã được lọc rửa [50]. Việc lọc rửa đã giúp chọn lọc được những tinh trùng có chất