i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Lê Văn Bé - Viện trưởng Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) Nha Trang, ThS. Dương Hữu Thái – Trưởng Phòng Vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang và ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị Phòng vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y Nha Trang đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên Hà Thị Hoa ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM 5 1.2.1. Vacxin cúm mùa 5 1.2.2. Các dạng vacxin cúm mùa 5 1.2.2.1. Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết) 5 1.2.2.2. Vacxin sống giảm độc lực 7 1.2.3. Các công nghệ sản xuất vacxin cúm 8 1.2.3.1. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi 8 1.2.3.2. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào 9 1.2.3.3. Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác 10 1.2.4. Vacxin cúm A/H1N1/09 11 1.3. Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 14 1.3.2. Tiêu chuẩn của vacxin cúm 16 1.4. Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vacxin cúm 16 1.4.1. Beta- propiolactone (BPL) 16 1.4.2. Formalin (Formaldehyde) 17 1.5. Quy trình bất hoạt virus cúm 21 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.1.1. Vật liệu 22 iii 2.1.2. Dung dịch kháng nguyên virus 22 2.1.3. Thiết bị 22 2.1.4. Dụng cụ và hóa chất 22 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Một số phương pháp kiểm định (test) 25 2.2.1.1. Phương pháp xác định hiệu giá HA (HAU) 25 2.2.1.2. Phương pháp xác định hiệu lực bất hoạt (RIV) 26 2.2.1.3. Phương pháp kiểm tra hàm lượng HA (phản ứng SRID) 27 2.2.1.4. Phương pháp xác định liều gây nhiễm trên trứng gà có phôi (EID50) 28 2.2.2. Phương pháp lấy mẫu sau bất hoạt 29 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu chọn nồng độ formalin thích hợp 29 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu chọn nhiệt độ và thời gian bất hoạt 30 2.2.5. Xây dựng quy trình bất hoạt 32 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Kết quả khảo sát nồng độ formalin bất hoạt 33 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian bất hoạt 36 3.2.1. Kết quả khảo sát hiệu giá HA 37 3.2.2. Kết quả khảo sát EID50 38 3.2.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 nhóm nhiệt độ 40 3.2.4. Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên (SRID) 41 3.3. Xây dựng quy trình bất hoạt 43 3.3.1. Khảo sát tính ổn định và hiệu quả của quy trình bất hoạt 44 3.3.2. Khảo sát tính an toàn của quy trình bất hoạt 45 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1. KẾT LUẬN 47 4.2. KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT CAIV : Cold-adapted Attenuated Influenza Vaccine DNA : Deoxyribonucleic Acid DPT : Diptheria – Pertussis – Tetanus (Vaccine bạch hầu – ho gà – uốn ván) EID50 : Egg Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50 virus trên trứng gà) EU : Endotoxin Unit (đơn vị nội độc tố) HA : Haemagglutinin (Protein ngưng kết hồng cầu) HAU : Haemagglutination Unit (Đơn vị Haemagglutinin) HI : Haemagglutination Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) IVAC : Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế NA : Neuraminidase (enzyme bề mặt virus cúm) NIBSC : National Insitute for Biological Sandards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh) PBS : Phosphat Buffer Saline (dung dịch đệm muối, Photphat) RNA : Ribonucleic Acid RIV : Residual Infectious Viruses (virus sống tồn lưu) SA : Sialic Acid SRID : Single Radial Immuno Diffusion (Khuyếch tán miễn dịch vòng đơn) TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới TIV : Trivalent - inactivated Influenza Vaccine (Vaccine cúm ba thành phần bất hoạt) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin 7 Bảng 2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến 96 giếng 26 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát HA của 3 lô thử nghiệm 33 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát RIV của 3 lô thử nghiệm 34 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát SRID của 3 lô thử nghiệm 35 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian khác nhau ở 3 lô thử nghiệm 37 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát EID50 của 3 lô thử nghiệm ở các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt 39 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 lô sản xuất 40 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) của 3 lô ở các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt 41 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát HA, SRID, RIV và EID50 của 3 lô sản xuất ở các thời gian khác nhau trong quy trình bất hoạt 44 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng formalin tồn dư, Endotoxin và Ovalbumin của 3 lô sau khi bất hoạt 45 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A 3 Hình 1.2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt 6 Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi 14 Hình 1.4 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 21 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ formalin 30 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian bất hoạt 31 Hình 3.1 Hiệu suất bất hoạt trung bình của 3 lô 35 Hình 3.2 Hàm lượng trung bình kháng nguyên HA của 3 lô thử nghiệm (µg/ml) 42 Hình 3.3 Quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 43 1 MỞ ĐẦU Dịch cúm A/H1N1/09 bùng phát đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng 3/2009, đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận. Chỉ tính đến ngày 17/6/2009, dịch xảy ra trên 86 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với 339.620 người mắc và có 167 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là Mehico: 08 người và Mỹ: 44 người; Về sau dịch lan nhanh ra hầu hết các nước trên thế giới với số người chết nhiều hơn. Điểm đặc biệt của đại dịch cúm này là tốc độ lây lan từ người sang người rất nhanh và những trường hợp tử vong thường rơi vào lứa tuổi từ 20 - 45 tuổi cho thấy tính chất nguy hiểm của dịch. Trước tình hình này, WHO (Tổ chức Y tế Thế giới) đã phát triển mở rộng chương trình phòng chống cúm toàn cầu nhằm tìm ra biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát đại dịch. Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa, kiểm soát và đẩy lùi dịch bệnh nói chung và bệnh cúm nói riêng. Tuy nhiên, việc sản xuất ra một lượng vacxin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng trên toàn thế giới còn gặp nhiều khó khăn do năng lực sản xuất ở các quốc gia không đồng đều và những thách thức về công nghệ. Để giải quyết vấn đề này, các nhà sản xuất vacxin tập chung đầu tư nghiên cứu nhiều dạng vacxin cúm khác nhau: Vacxin cúm bất hoạt, vacxin sống và vacxin tái tổ hợp. Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin cúm A/H1N1/09 bất hoạt trên trứng gà có phôi trên quy mô thí nghiệm. Hiện nay việc mở rộng sản xuất trên quy mô lớn, trong đó việc phát triển quy trình bất hoạt virus cúm nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng là vấn đề được quan tâm đầu tư. Formalin là hóa chất được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều loại vacxin cho người. Tuy nhiên xác lập quy trình bất hoạt đối với mỗi loại vacxin, sinh phẩm cần được xác định các thông số cụ thể như nồng độ formalin thích hợp là bao nhiêu và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình bất hoạt để 2 đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tàì: “Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09”. Mục tiêu của đề tài 1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09. 2. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09 Virus cúm A có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy). Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ capsid, vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm [12]. Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A Capsde là vỏ protein được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome. Capsome lại được cấu tạo từ các đơn vị cấu trúc gọi là protome. Vỏ capsid của virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus. Màng ngoài có bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất 4 cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các thành phần khác của virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm. Vật liệu di truyền (còn gọi là hệ gene) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, Pa, Pb1 và Pb2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus. Bộ gen nhiều phân đoạn của virus là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng virus mới. Có hai kiểu thay đổi kháng nguyên là hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) và biến thể kháng nguyên (antigenic driff). Hoán vị kháng nguyên là sự thay đổi di truyền quan trọng do sự tái tổ hợp gen giữa các chủng khác nhau tạo ra. Biến thể kháng nguyên là do đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin dẫn đến sự thay đổi một số acid amin trong protein haemagglutinin [14], [23], [25]. Tính chất kháng nguyên Haemagglutinin và Neuraminidase là hai kháng nguyên quan trọng nhất, quyết định độc tính của virus cúm. * Haemagglutinin (HA) HA là một glycoprotein, dạng hình nấm, nhô ra từ màng lipid của virus, phía ngoài có tán hình cầu. HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của các động vật máu nóng. HA mang tính chất kháng nguyên và là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định đến tính độc của virus cúm, có khả năng gắn vào thụ thể đặc hiệu của tế bào chủ. Trong quá trình gây bệnh, virus cúm có 16 loại HA, được kí hiệu từ H1 đến H16. * Neuraminidase (NA) NA là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề mặt vỏ của virus cúm. NA có hai phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng, vùng còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng virus. NA có chức năng phân cắt sialic acid bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm keto với D-glactose hoặc D- glactosesamine của acid sialic. Phản ứng này cho phép virus vượt qua lớp niêm dịch [...]... Vacxin cỳm b t ho t (vacxin ch t) H u h t cỏc lo i vacxin cỳm hi n nay trờn th gi i l vacxin b t ho t 3 thnh ph n (kớ hi u TIV) g m hai ch ng cỳm A l H1N1, H3N2 v m t ch ng virus cỳm B M i li u vacxin ch a 15àg khỏng nguyờn m i ch ng virus thnh ph n 6 TIV g m cỏc lo i: Vacxin ton thõn, vacxin ti u ph n v vacxin khỏng nguyờn tinh ch - Vacxin ton ph n virus (whole virus vaccine) l vacxin th h th nh t... t trong formalin cao kh nng b t ho t virus cng t t, song no ú formalin cú th phỏ h y cỏc khỏng nguyờn c a virus, ng th i l ng formalin t n d trong quỏ trỡnh b t ho t nhi u nh h ng khụng t t t i ch t l ng vacxin n ng formalin th p kh nng b t ho t virus kộm, kộo di th i gian b t ho t ho c virus khụng c b t ho t hon ton, hi u l c b t ho t khụng t Vỡ v y, n ng formalin l a ch n ph i m b o b t ho t virus. .. u qu nờn formalin v n c cỏc nh s n xu t s d ng, g n õy nh t l formalin c s d ng thnh cụng trong b t ho t virus cỳm s n xu t vacxin cỳm A/H5N1 Theo khuy n cỏo c a WHO thỡ húa ch t b t ho t virus l formalin hay betapropiolacton quỏ n ng u c phộp s d ng trong s n xu t vacxin, nhng khụng c v t cho phộp (n ng theo th tớch khụng c v t quỏ 0,1% b t k lỳc no trong quỏ trỡnh b t ho t) Hm l ng formalin. .. i vacxin * Nh c i m - Th i gian phõn gi i ch m nờn quỏ trỡnh b t ho t kộo di - Hm l ng formalin cao nh h ng khụng t t t i s c kh e con ng i c, Tỡnh hỡnh s d ng formalin [3], [16] Formalin l m t húa ch t b t ho t truy n th ng Nm 1923 vacxin gi i b ch h u do Gleumy - Ramon b t ho t b ng formalin ra ct i, ti p sau ú l cỏc vacxin vi khu n b t ho t b ng formalin (vacxin t , ho g, thng hn) v cỏc vacxin virus. .. nng ti p xỳc c a formalin v i virus, giỳp quỏ trỡnh b t ho t x y ra nhanh, ng u; nh t c a dung d ch cú nh h ng t i kh nng khu y v kh nng ti p xỳc c a formalin v i virus o 21 1.5 Quy trỡnh b t ho t virus cỳm D ch virus Cho dung d ch m L c tr c b t ho t B t ho t b ng formalin Khu y t L c sau b t ho t Khu y t nhi t phũng Ly gi i ng Hỡnh 1.4 S quy trỡnh b t ho t virus cỳm A/H1N1/09 (theo quy trỡnh b t ho... cú phụi, virus c b t ho t b ng formalin ho c - propiolactone õy l lo i vacxin an ton, dung n p t t, hi u qu b o v 75 90 % - Vacxin m nh virus (split vaccine) l vacxin th h th hai (1968), cng c s n xu t nh vacxin ton thõn nhng khụng nguyờn v n h t virus m c tỏch ra t ng m nh khỏng nguyờn b m t, nucleocapsid, cỏc protein nh cụng o n dựng h n h p húa ch t tõy r a tỏch b t cỏc lipid v - Vacxin khỏng... nghiờn c u s n xu t vacxin cỳm A/H1N1 b t ho t b ng formalin trờn tr ng g cú phụi quy mụ phũng thớ nghi m Tuy nhiờn, khi phỏt tri n cụng ngh s n xu t quy mụ cụng nghi p c n ph i xem xột cỏc y u t : - Th i gian b t ho t - Hi u giỏ HA tr c v sau b t ho t Cú r t nhi u y u t nh h ng t i hi u qu b t ho t virus c a formalin bao g m: n ng formalin, nhi t tr ng, t c khu y - N ng o ) formalin l m t trong s 3 y u... c c p phộp s d ng cho vacxin cỳm M v Chõu u [7], [9] Hỡnh 1 2 Mụ hỡnh cỏc d ng vacxin phũng cỳm b t ho t 7 1.2.2.2 Vacxin s ng gi m Vacxin s ng nh c cl c c thớch ng l nh (kớ hi u CAIV) l vacxin khớ dung, mi n d ch b ng ng mi, c s n xu t t ch ng virus cú do t bi n Ch ng m i sao chộp thu n l i 35 - 370C) virus s b nh c c tớnh thớch ng l nh 250C nhng trong c th ng i (nhi t c Vacxin CAIV hi u qu cao,... nuụi c y trong mụi tr ng khụng cú huy t thanh v ó c ch p nh n s n xu t vacxin cho ng i Nh nh ng ti n b c a khoa h c cụng ngh , th gi i ang ti n t i m c tiờu s n xu t vacxin an ton hn v i tr hn [9], [25] 1.2.2 Cỏc d ng vacxin cỳm mựa Vacxin cỳm mựa ch y u c s n xu t b ng phng phỏp nuụi c y trờn tr ng g cú phụi Cú hai lo i vacxin cỳm truy n th ng l vacxin b t ho t v vacxin s ng gi m c l c 1.2.2.1 Vacxin. .. v d ng polymer paraformaldehyde Trong n c, formalin s n ph n trung gian khi khụng khớ, formalin d ng H2C(OH)2 Formalin l t methane hay cỏc h p ch t ch a carbon khỏc Trong c t o ra do ph n ng c a oxy v i methane hay cỏc hydrocarbon d i tỏc d ng c a ỏnh sỏng m t tr i nhi t phũng, formalin d ng khớ, d ho tan trong n c v i n ng kho ng 37%, b n v ng v i methanol 10 - 15% Trong n c, a ph n formaldehyde . các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09. 2. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09. . tạo virus cúm A 3 Hình 1.2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt 6 Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi 14 Hình 1.4 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus. cứu sản xuất thành công vacxin cúm A/H1N1/09 bất hoạt trên trứng gà có phôi trên quy mô thí nghiệm. Hiện nay việc mở rộng sản xuất trên quy mô lớn, trong đó việc phát triển quy trình bất hoạt