KỸ THUẬT ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) TRONG XÁC ĐỊNH CHỦNG MYCOBACTERIA VÀ TRONG CHẨN ĐOÁN SÀNG LỌC BỆNH LAO I. NGUYÊN TẮC: Kỹ thuật ELISA KỸ THUẬT ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) TRONG XÁC ĐỊNH CHỦNG MYCOBACTERIA VÀ TRONG CHẨN ĐOÁN SÀNG LỌC BỆNH LAO I. NGUYÊN TẮC: Kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đặc hiệu để xác định kháng nguyên – tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy sớm hoặc trực tiếp trong bệnh phẩm bệnh nhân và ngược lại, sử dụng kháng nguyên đã biết để phát hiện kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh hoặc dịch tiết của cơ thể bệnh nhân, qua đó đánh giá được tình trạng nhiễm bệnh của cơ thể. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ được nhận biết bởi cộng hợp kháng huyết thanh tương ứng gắn với enzyme peroxidaza hoặc phosphataza… gây chuyển mầu cơ chất phù hợp. Kết quả phản ứng được đo bằng thiết bị đo quang phổ và thông qua độ đậm đặc khác nhau của mầu sắc mà đánh giá mức độ phản ứng của mẫu xét nghiệm. II. NGUYÊN VẬT LIỆU CƠ BẢN: 1. Máy đọc ELISAcó bước sóng 450nm 2. Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng(của hãng NUNC, Denmark ) 3. Pipetman loại20, 200, 1000 microlit và đầu côn tương ứng 4. Kháng nguyên Mycobacterium tuberculosis 5. Huyết thanh bệnh nhân: lấy khoảng 2mlmáu của bệnh nhân chắt lấy huyết thanh bảo quản ở –20 0 C. 6. Dung dịch đệm gắnbản: PBS, pH=7,2 Thành phần của PBS: - Na 2 HPO 4 12 H 2 O = 1,72g Hoặc Na 2 HPO 4 2 H 2 O = 0,85gr - KH 2 PO 4 = 0,254 gr - NaCl = 8,5gr - Nước cất 2 lần = 1000 ml 7. Dung dịch đệm rửa bản: PBS -Tween 0,05 % ( PBS-T), pH= 7,2 Thành phần của PBS-T 0,05%: Hoà tan 500 ul Tween 20 trong 1000 ml PBS. 8. Dung dịch cơ chất TMB (Tetramethyl benzidine) Thành phần: - TMB = 6 mg - Cồn Ethanol 700 C = 5ml - Citrat buffer pH 5 = 5ml - H 2 O 2 = 5ml 9. Cộng hợp kháng huyết thanh dê kháng IgM, IgG người có gắn men Peroxydaza(Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp). 10.Cộng hợp kháng huyết thanh dê kháng IgG thỏgắn men peroxidaza (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp) 11.Kháng huyết thanh thỏ kháng M.tuberculosis(Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp) 12.Kháng thể đơn clôn kháng đặc hiệu M.tuberculosis hoặc khángLipoarabinomannan (LAM) 13.Dung dịch dừng phản ứng : H 2 SO 4 1N 14.Huyết thanh bệnh nhân: lấy khoảng 2mlmáu của đối tượng nghiên cứu chắt lấy huyết thanh, bảo quản ở –20 0 C để sử dụng. III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN ELISA III.1 Kỹ thuật elisa trực tiếp định loại một số mycobacteria gây bệnh Nguyên tắc: Sử dụng các kháng thể đơn clôn đặc hiệu với chủng Mycobacteria để nhận biết chủng tương ứng phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân. III.1.1. Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn phủ bản: - Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân trên môi trường Lowenstein trong 8 tuần ở 37 0 C - Lấy một lượng vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc trên môi trường bằng khoảng 1/3 -1/2 vòng tròn đầu que cấy, hoà đều trong 0,35 ul PBS. Với chủng chuẩn cũng tiến hành tương tự - Đun nóng hỗn dịch vi khuẩn ở 80 o C trong 5 phút để giết vi khuẩn - Nghiền (sonicate) sơ bộ hỗn dịch trong 3 giây để làm tan cụm vi khuẩn trong hỗn dịch - Đo nồng độ vi khuẩn bằng máy đo quang phổ, bước sóng 420 nm. OD bằng 1,5 tương đương với 1x10 9 vi khuẩn/ml. Đây là nồng độ cần thiết để phủ bản III.1.2. Quy trình thực hiện ELISA: - Phủ bản với 25 ul kháng nguyên Mycobacteria (chủng mycobacteria phân lập từ bệnh phẩm, hoà tan với PBS theo nồng độ 2x 10 9 tế bào vi khuẩn/ml, hoặc xác định nồng độ bằng đo mật độ quang học: OD = 1.50 tương đương với 1 x 10 9 vi khuẩn/ml ) trong một giếng ở nhiệt độ 37 o C qua đêm không đậy nắp hoặc để khô ở nhiệt độ 58-60 o C - Phong bế chỗ trống bằng 100ul dung dịch PBS-BSA 1%, ủ ở 37 o C x 1 h - Ủ với 50 ul kháng thể đơn clôn kháng đặc hiệu M.tuberculosis, M.avium. M.kansasii đã được pha loãng 1/1.000 lần trong PBS-BSA 1% v.v ở 37 o C x 1 giờ - Rửa bản với dung dịch đệm PBS-T 0,05% 3 -5 lần - Ủ với 50 ul cộng hợp kháng IgG chuột gắn peroxidaza (pha loãng 1:1.000 lần với PBS-BSA1% ở 37 o C trong 1 giờ - Ủ với 100 ul cơ chất 30-60 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối - Đọc kết quả ở bước sóng 405nm và ghi nhận kết quả: OD 405 < 0,8 = âm tính ; OD 405 >0,8 = dương tính, III.2. Kỹ thuật elisa xác định kháng thể đặc hiệu kháng M. tuberculosis ở huyết thanh và chất dịch tiết của bệnh nhân lao 1. Gắn kháng nguyên:Cho 50 ml kháng nguyên gồm vi khuẩn nguyên thể (với nồng độ 10 9 tế bào/ml) hoặc ở dạng siêu nghiền đã pha loãng ở nồng độ 10mg/1ml trong dung dịch đệm PBS vào mỗi giếng của bản, ủ ở 37 o C qua đêm hoặc ở 56 o C trong 4h. 2. Rửa bản với dung dịch rửa PBS-Tween 0,05% (3-5 lần) 3. Nhỏ 50 ml huyết thanh bệnh nhân pha loãng với nồng độ tối ưu đối với từng cộng đồng đã được xác định từ trước (với PBS-Tween-BSA 1%) vào mỗi giếng và ủ ở 37 o C/1h 4. Rửa bản như bước 2 5. Nhỏ 50 ml cộng hợp huyết thanh dê kháng IgG hoặc IgM (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp) người gắn peroxidase vào mỗi giếng của bản, ủ ở 37 o C trong 1h 6. Làm như bước 2 7. Cho 100ml cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ trong tủ ấm 37 o C trong 15-30 phút. 8. Dừng phản ứng bằng cho 100 ml H 2 SO 4 vào mỗi giếng 9. Đọc kết quả với máy đọc ELISA bước sóng 405 nm III.3. Phân tích kết quả Kết quả xác định kháng thể kháng đặc hiệu M.tuberculosis được phân tích thông qua giá trị mật độ quang học (OD) trung bình của hai giếng đối với một mẫu, so sánh với giá trị ngưỡng (được tính bằng giá trị OD trung bình của quần thể người khoẻ mạnh cộng với 2 lần giá trị độ lệch chuẩn SD). Giá trị ngưỡng của từng bộ sinh phẩm hoặc của từng cộng đồng khác nhau sẽ khác nhau phụ thuộc vào kết quả đánh giá trên huyết thanh người khoẻ mạnh của cộng đồng nghiên cứu. Kết quả phản ứng dương tính sẽ là giá trị > giá trị ngưỡng; Kết quả phản ứng âm tính sẽ < giá trị ngưỡng Chú ý: Giá trị OD của hai giếng trên cùng một mẫu lệch nhau gấp đôi thì cần xét nghiệm lại mẫu đó. . KỸ THUẬT ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) TRONG XÁC ĐỊNH CHỦNG MYCOBACTERIA VÀ TRONG CHẨN ĐOÁN SÀNG LỌC BỆNH LAO I. NGUYÊN TẮC: Kỹ thuật ELISA KỸ THUẬT ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT. IMMUNOSORBENT ASSAY) TRONG XÁC ĐỊNH CHỦNG MYCOBACTERIA VÀ TRONG CHẨN ĐOÁN SÀNG LỌC BỆNH LAO I. NGUYÊN TẮC: Kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đặc hiệu để xác định kháng nguyên – tác nhân gây bệnh trong. của đ i tượng nghiên cứu chắt lấy huyết thanh, bảo quản ở –20 0 C để sử dụng. III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN ELISA III.1 Kỹ thuật elisa trực tiếp định lo i một số mycobacteria gây bệnh Nguyên tắc: