27 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 63, 2010 PHÂN LẬP FLAVONOID TỪ CAO BUTANOL TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA THUNB) Ở TỈNH THỪA THIÊN HUẾ Phan Văn Cư Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế TÓM TẮT Nghiên cứu tách chiết flavonoid từ lá của cây Diếp cá ở Thừa Thiên Huế được thực hiện. Quá trình sử dụng hai dung môi là dung dịch aceton và ethanol 96 0 C. Kết quả chỉ ra rằng, sử dụng dung môi ethanol để tách chiết là phù hợp. Từ cao butanol, một cấu tử tinh khiết đã được phân lập. Cấu trúc của hợp chất này được nhận dạng là quercetin-3-O-rutinosid (rutin) bằng những phương pháp phổ. 1. Mở đầu Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb, thuộc họ lá Giấp (Saururaceae). Diếp cá là một loại cây thảo, mọc rất phổ biến ở Việt Nam và một số nước châu Á dùng để chữa nhiều bệnh như trĩ, phù thũng, thoát mủ, thông tiểu tiện, viêm, giải độc, thanh nhiệt Sở dĩ như vậy là vì trong cây diếp cá có chứa một số hoạt chất có tính kháng khuẩn và chống oxy hoá [1], [5]. Ở Việt Nam, Đỗ Tất Lợi, Trần Huy Thái [5] đã nghiên cứu chiết xuất tinh dầu diếp cá ở miền Bắc bằng phương pháp chưng cất thông thường Hoàng Thanh Hương [4] đã nghiên cứu tách chiết flavonoid. Còn ở miền Nam, miền Trung, chúng tôi chưa tìm thấy tác giả nào nghiên cứu tách chiết tinh dầu diếp cá, đặc biệt là dùng phương pháp vi sóng và flavonoid. Rõ ràng, việc nghiên cứu tách chiết, xác định hàm lượng, thành phần hóa học của tinh dầu, flavonoid trong cây Diếp cá ở tỉnh Thừa Thiên Huế là rất cần thiết. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu được thu mua ở xã Quảng Thành, huyện Quảng Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế. Đây là vùng chuyên canh trồng rau màu phục vụ thành phố Huế. Nguyên liệu được thu mua vào tháng 2, 4 năm 2006 đến 2009. Mẫu được định danh bởi ThS. Nguyễn Việt Thắng, Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết flavonoid tổng, thô bằng phương pháp ngâm chiết Nguyên liệu diếp cá khô sau khi đã được xử lý cho vào thùng dung tích 5 lít, cho tiếp cồn 96 0 , khuấy cho nguyên liệu thấm đều dung môi, đậy kín thùng. Tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 3 ngày, gộp các dịch chiết. Cất đuổi dung môi, sau đó chiết lần lượt với các dung môi hexan, etyl acetat và butanol thu được các cao tương ứng hexan, etyl acetat và butanol. 2.2.2. Định tính flavonoid tổng thô bằng phương pháp hóa học và SKLM [2] - Phản ứng Shinoda, dung dịch kiềm, hơi NH 3 và dung dịch FeCl 3 . - Hòa tan một lượng nhỏ cao butanol vào etanol tuyệt đối vừa đủ, tiến hành sắc ký lớp mỏng với bản mỏng silicagel (MERCK) 60-F254 tráng sẵn. Dung môi khai triển bao gồm: Hệ I: etyl acetat : metanol = 4 : 6; Hệ II: etyl acetat : metanol : nước = 10 : 2 : 2. Hệ III: etyl acetat : acid formic : nước = 8 : 1 : 1. Kiểm tra bằng thuốc thử hiện màu: soi UV, NH 3 , dung dịch H 2 SO 4 10%/etanol. Kết quả chọn hệ III: etyl acetat : acid formic : nước = 8 : 1 : 1 là phù hợp. 2.2.3. Phân lập flavonoid tổng bằng phương pháp sắc ký cột [2], [3], [8] Để phân lập, đầu tiên chúng tôi tinh chế lại cao butanol nhiều lần, sau đó sử dụng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel (MERCK) 60-200µm theo phương pháp nhồi ướt. Cột được nhồi với 64 gam silicagel với tỷ lệ đường kính cột so với chiều cao cột nhồi là 3/32, lượng mẫu thử là 3,4079 gam cao butanol 2.2.4. Xác định, nhận dạng cấu tử đã phân lập được bằng phổ IR, 1 H-NMR, 13 C- NMR, DEPT và MS tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Tách chiết flavonoid tổng, thô bằng phương pháp ngâm chiết Khối lượng mẫu diếp cá khô là 330 g, độ ẩm theo phương pháp khối lượng tại điều kiện nghiên cứu là 11,43% thu hàm lượng flavonoid tổng, trung bình là 2,73%. 3.2. Định tính flavonoid tổng trong cao butanol bằng SKLM Tiến hành sắc ký lớp mỏng (SKLM) với cao butanol tổng, kết quả SKLM ở hệ III (etyl acetat:acid formic:nước = 8:1:1 v/v/v/) có tối thiểu 6 cấu tử ứng với R f = 0,18; 0,29; 0,37; 0,67; 0,71; 0,87. Cấu tử tách ra rõ ràng, riêng biệt nên chọn hệ dung môi này để tiến hành sắc ký cột. 29 3.3. Phân lập một cấu tử trong cao butanol của cây Diếp cá 3.3.1 Phân lập Tiến hành rửa giải với các dung môi Ete dầu - etyl acetat= 70 : 30, 50 : 50, 20 : 80 (v/v) và Etyl acetat - acid formic- nước = 80 : 10 : 10; 70 : 15 : 15 (v/v/v), tốc độ giọt 48 giọt/phút thu được 49 ống, thể tích mỗi ống khoảng 10 ml, sau đó, gộp các ống có R f vết giống nhau : Phân đoạn I: màu vàng; Phân đoạn II: màu nâu Phân đoạn III: màu nâu; Phân đoạn IV: màu nâu đậm. Chúng tôi chọn phân đoạn IV trên SKLM cho 1 vết riêng biệt để tinh chế. 3.3.2. Tinh chế và xác định cấu trúc cấu tử có R f = 0,18 + Tinh chế Tiến hành tinh chế phân đoạn IV (cấu tử R f = 0,18) nhiều lần trong hỗn hợp dung môi toluen: metanol [6] thu được tinh thể màu vàng, định tính lại trong 2 hệ dung môi etyl acetat - acid formic - nước = 8 : 1: 1 (v/v/v) và etyl acetat - metanol - nước = 10 : 2 : 2 (v/v/v), kết quả đều thu được 1 vết tròn chứng tỏ cấu tử là đơn chất. Mẫu được ký hiệu là CU6DC, chúng tôi tiến hành gửi mẫu để ghi phổ tại phòng nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa học và Công nghệ Việt Nam. + Xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR-DEPT, MS. ● Phổ IR (KBr): Dao động hoá trị νOH 3421cm -1 , là nhóm OH phenol, dao động C=O ở 1657m -1 , có nhân benzen trong phân tử nên có dao động tại 1599cm -1 ; ngoài ra dao động ở 1063m -1 là của C-O-C. Hình 1. Công thức cấu tạo của rutin Các dữ liệu phổ 13 C-NMR, 1 H-NMR của CU6DC phù hợp hoàn toàn so với các giá trị tương ứng đã được công bố trong các tài liệu [3], [7] cho phép dự đoán công thức cấu tạo của CU6DC là quercetin-3-O-rutinosid (rutin) với công thức cấu tạo ở hình 1. O O OH OH OH HO O O CH 2 OH OH HO CH 3 O O HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 1 ' 2 ' 3 ' 4 ' 1 '' 2 '' 6 '' 1 ''' 6 ''' 2 ''' 30 ● Phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR: Kết quả được chỉ ra ở bảng 1 và hình 2 sau: Bảng. Dữ kiện phổ của 1 H-NMR, 13 C-NMR của CU6DC so với rutin của tài liệu tham khảo [3,7] Vị trí C DEPT 13 C-NMR 1 H-NMR CU6DC Rutin [3] CU6DC Rutin [3] 2 C 158,475 158,53 3 C 135,696 135,63 4 C 179,387 179,44 5 C 162,909 162,99 6 CH 100,006 99,95 6,208 (d, J=2) 6,23 (d, J=2) 7 C 165,987 166,01 8 CH 94,974 94,87 6,389 (d, J=2) 6,42 (d, J=2) 9 C 159,344 159,35 10 C 105,646 105,65 1’ C 123,162 123,15 2’ CH 116,108 117,70 7,688 (d, J=2) 7,69 (d, J=2) 3’ C 145,811 145,85 4’ C 149,797 149,81 5’ CH 117,785 116,07 6,890 (d, J= 8,5) 6,90 (d, J=8,5) 6’ CH 123,640 123,56 7,647 (dd, J 1 = 8,5; J 2 = 2) 7,65 (dd, J 1 =8,5; J 2 =2) 1’’ CH 104,823 104,71 5,120 (d, J=7,5) 5,13 (d, J=7,0) 2’’ CH 75,773 75,74 3,51 br s 3’’ CH 78,215 78,20 3,42 m 4’’ CH 71,428 71,41 3,674 (dd, J 1 =3,5; J 2 =1,5) 3,30 m 5’’ CH 77,206 77,24 3,34 m 6’’ CH 2 68,607 68,56 3,830 (dd, J 1 =10; J 2 =1) 3,570 dd, J 1 =10, J 2 =3) 3,84 m 3,81 m 1’’’ CH 102,439 102,42 4,549 (d, J=1) 4,54 (d, J=7,0) 2’’’ CH 72,120 72,11 3,65 (dd, J 1 =1,5; J 2 = 5,0) 3’’’ CH 72,298 72,26 3,55 (dd, J 1 = 3,5, J 2 = 13,0) 4’’’ CH 73,993 73,94 3,32 (m) 5’’’ CH 69,737 69,71 3,47 (m) 6’’’ CH 3 17,924 17,87 1,147 (d, J=6,5) 1,13 (d, J=6,0) 31 Hình 2. Phổ 13 C-NMR và DEPT của CU6DC ● Phổ MS So với các tài liệu tham khảo [3], [7] rutin có M=610 tương ứng với công thức phân tử C 27 H 30 O 16 . Theo Chu Đình Kính, trên phổ MS xuất liện peak m/z=446 chứng tỏ phân tử đã mất đi một phân tử đường có M=164 chính là đường -L-rhamnose. Tiếp tục mất đi một phân tử đường thứ 2 còn lại phần aglycon có m/z=302. Kết quả phổ MS của CU6DC có peak cơ bản là m/z=302, 273, 228, 153, 153, 109, 85, 60 trùng với các peak của quercetin. Điều này cho phép khẳng định CU6DC có aglycon là quercetin. Kết luận: Căn cứ dữ kiện các phổ IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR-DEPT, MS và các dữ kiện phổ ở các tài liệu [11], [25] đã công bố, chúng tôi khẳng định cấu tử CU6DC là quercetin-3-O-rutinosid hay quercetin-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl- (1  6)-O-β-D- glucopyranosid] hay rutin. 32 4. Kết luận 4.1. Hàm lượng flavonoid tổng, thô trung bình khi tách chiết bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi etanol 96 0 là 2,73%. 4.2. Bằng phương pháp SKC chúng tôi đã phân lập được một cấu tử R f = 0,18 (CU6DC) từ cao butanol, tinh thể màu vàng. Dựa vào các dữ kiện phổ IR, 1 H- NMR, !3 C-NMR, MS chúng tôi xác định công thức cấu tạo của cấu tử phân lập được là quercetin-3-O-rutinosid (rutin). TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bộ Y tế, Viện dược liệu, Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2006. [2]. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Việt Tựu, Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nxb Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 1985. [3]. Nguyễn Thị Bích Hằng và cộng sự, Rutin, scutellariosid II và leonuisid A phân lập từ lá cây vọng cách (Premma corymbosa Rottl.ex Willd), Tạp chí Dược học, số 4, 2008. [4]. Hoàng Thanh Hương và cộng sự, Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ cây diếp cá của Việt Nam, Tạp chí Dược học, số 9, 2002. [5]. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2006. [6]. Martha Windhol, The Merck index, Published by Merck.co, inc. Rahway, N.j, USA. 1983. [7]. Michelle F. Muzitano et al. The antileishmanial activity assessment of unusual flavonoids from Kalanchoe pinnata, Phytochemistry 67, (2006), 2071-2077. [8]. Shu-Chen Chou, Tian-Shung Wu, The constituents of the Houttuynia cordata Thunb, www.etd-0626106-191008 China pdf, 2008. THE ISOLATION OF FLAVONOIDS FROM THE BUTANOLIC EXTRACT IN HOUTTUYNIA CORDATA THUNB IN THUA THIEN HUE PROVINCE Phan Van Cu College of Sciences, Hue University SUMMARY An investigation into the separation of flavonoids from Houttuynia cordata Thunb leaves was carried out. Flavonoids were separated by two solvents namely acetone 70% and ethanol 96 0 C. The result shows that ethanol is the suitable solvent for the separation process. From the butanolic extract, a pure constituent was isolated. The structure of this compound was elucidated as quercetin-3-O-rutinosid (rutin) by spectroscopic methods. . TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 63, 2010 PHÂN LẬP FLAVONOID TỪ CAO BUTANOL TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA THUNB) Ở TỈNH THỪA THIÊN HUẾ Phan Văn Cư Trường Đại học Khoa học,. dầu diếp cá, đặc biệt là dùng phương pháp vi sóng và flavonoid. Rõ ràng, việc nghiên cứu tách chiết, xác định hàm lượng, thành phần hóa học của tinh dầu, flavonoid trong cây Diếp cá ở tỉnh Thừa. HUẾ Phan Văn Cư Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế TÓM TẮT Nghiên cứu tách chiết flavonoid từ lá của cây Diếp cá ở Thừa Thiên Huế được thực hiện. Quá trình sử dụng hai dung môi là dung