81 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN UNG TH Ư BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT (CHRONIC MYELOID LEUKEMIA ) Phan ình i n B nh Vi n Ch R y TP. H Chí Minh Ph m Hùng Vân, Nguy n Thái S n i h c Y D c TP. H Chí Minh TÓM TẮT Sáu m i m u máu c a b nh nhân c ch n oán b nh ung th b ch c u m n tính dòng h t (Chronic Myeloid Leukemia-CML) c nghiên c u phát hi n nhi m s c th Philadelphia mang gen t h p BCR-ABL b ng k thu t RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) và real-time PCR. K t qu cho th y có n 59 b nh nhân (98,33%) mang gen t h p này trong máu ngo i biên, trong ó, d ng BCR-ABLb2a2 chi m 32,20%, d ng BCR-ABLb3a2 chi m 44,07% và d ng k t h p BCR-ABLb2a2+b3a2 chi m 23,73%. K t qu này cho th y có th dùng k thu t PCR phát hi n nhi m s c th Philadelphia. Vi c so sánh i chi u k t qu này v i các tác gi khác trong và ngoài n c c ng c bàn lu n kh ng nh giá tr c a k thu t. 1. Đặt vấn đề B ệnh ung thư bạch cầu mạn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) là m ột bệnh ác tính của hệ tạo máu với đặc điểm chính là sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt. Trong b ệnh CML có một sự biến đổi nhiễm sắc thể đặc trưng đó là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph) (Nowel et al 1960) [4], đây là sản phẩm của sự chuyển đoạn giữa nhi ễm sắc thể số 9 và nhiễm sắc thể số 22 ký hiệu t(9;22) (Rowley 1973) [5]. Theo khảo sát c ủa các nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới, nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện ở máu ngoại biên và tuỷ xương của bệnh nhân CML là lớn hơn 95% (Carol D. Jone, Cecilia Yeung et al.2003. Susan Branford 2006) [1,8]. Nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy bản chất gen của nhiễm sắc thể Philadelphia là gen t ổ hợp BCR-ABL (Salesse et al 2002) [6] được tạo thành do sự chuy ển đoạn của ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc thể số 9 đến gắn vào vị trí 5’ của BCR gene trên nhánh dài nhi ễm sắc thể số 22 (q34;q11). Trong bệnh CML, gen tổ hợp BCR-ABL ch ủ yếu sẽ tạo ra một loại protein có hoạt tính Tyrosine Kinase đó là protein P210 (protein có tr ọng lượng phân tử 210 KD) và protein này chính là nguyên nhân chủ 82 yếu gây ra bệnh CML (Sawyers, C.L.1999) [7] . Tùy theo vị trí sắp xếp các điểm gãy (breakpoints) khác nhau trên BCR-gene và ABL-gene ta có các s ản phẩm BCR-ABL khác nhau: BCR-ABL b2a2 n ếu vị trí sắp xếp các điểm gãy nằm giữa exon 13 và 14, hay đó sẽ là BCR-ABL b3a2 nếu vị trí sắp xếp các điểm gãy nằm ở giữa exon 14 và 15. (Salesse et al 2002) [6]. Phát hi ện được gen tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của b ệnh nhân CML đồng nghĩa với phát hiện được nhiễm sắc thể Philadelphia. Do vậy việc ti ến hành xây dựng một kỹ thuật mới để phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngo ại biên của bệnh nhân CML là một điều hết sức cần thiết trong ch ẩn đoán và điều trị. Hình 1. S t o thành gene BCR-ABL (Salesse et al 2002) 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng 60 b ệnh nhân (bao gồm 32 nữ, chiếm tỉ lệ 53,33% và 28 nam, chiếm tỉ lệ 46,67%) v ới độ tuổi nhỏ nhất là 20 đến lớn nhất là 74 tuổi, được chẩn đoán ung thư b ạch cầu mạn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia, CML) với tủy đồ dương tính và đang được điều trị bằng các loại thuốc Hydrea (Không sử dụng các loại thuốc ức chế ho ạt tính tyrosine kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib…) tại phòng khám huyết h ọc của Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05. 08. 2009 đến 19. 11. 2009. 2.2. Ph ương pháp 2.2.1. L ấy mẫu và bảo quản mẫu Lấy 04 ml máu tĩnh mạch ngoại biên, cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), l ắc nhẹ để trộn đều máu với chất chống đông, bảo quản ở nhiệt độ 4 – 8 0 C trong vòng 08 giờ phải chuyển đến phòng thí nghiệm để xử lý mẫu. 83 2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm Máu toàn ph ần sẽ được trích ly RNA với bộ thuốc thử đã được chuẩn hoá của Chomczynski [2] Khu ếch đại 2 týp của gene tổ hợp BCR-ABL là b2a2 và b3a2 bằng kỹ thu ật RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) sau đó tiến hành xét nghi ệm định lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng độ chuẩn của gen β-glucuronidase (GUS) S1: 100.000 b ản sao/ml, S2: 10.000 bản sao/ml và S3:1.000 bản sao/ml, được phát hi ện real time cùng với mẫu nghiệm. Phân tích k ết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software. 3. Kết quả 3.1.T ương quan giữ độ tuổi và bệnh CML (Chronic Myeloid Leukemia) B ng 1. M i t ng quan gi tu i và b nh CML Độ tuổi Số lượng Tỷ lệ % < 30 12 / 60 20,00 30 - 40 11 / 60 18,33 41 - 50 12 / 60 20,00 51 - 60 17 / 60 28,33 61 - 74 08 / 60 13,33 Những kết quả ghi nhận được cho thấy đa số bệnh nhân CML đều ở độ tuổi của ng ười đã trưởng thành, đặc biệt tỷ lệ này khá cao ở tuổi trung niên (41 – 60) # 58,33%. 3.2.Kết quả phân tích mẫu gen BCR-ABL từ 60 bệnh nhân CML Qua phân tích m ẫu máu ngoại biên của 60 bệnh nhân CML đã được xác định ch ẩn đoán với tủy đồ dương tính và đang điều trị ngoại trú tại Bệnh Viện Chợ Rẫy TP. H ồ Chí Minh, thuốc điều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea). Chưa có bệnh nhân nào được điều trị với các loại thuốc ức chế hoạt tính Tyrosine Kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib Chúng tôi đã phát hiện được 59/60 trường hợp (98,33%) mẫu máu được đem phân tích có sự hiện diện gen BCR-ABL. 3.2.1.T ần suất xuất hiện các dạng chuyển đoạn của nhiễm sắc thể Philadelphia B ng 2. T n su t xu t hi n c a nhi m s c th Philadelphia trong b nh nhân CML Mẫu nghiệm dương tính với BCR-ABL (N = 59) Vị trí chuyển đoạn Của nhiễm sắc thể Philadelphia S ố lượng phát hiện Tỷ lệ % BCR-ABL b2a2 19 32,20 BCR-ABL b3a2 26 44,07 BCR-ABL b2a2 + b3a2 14 23,73 84 Bằng kỹ thuật RT-PCR, gen tổ hợp BCR-ABL đã xuất hiện trong máu ngoại biên c ủa 59/60 bệnh nhân: 19 người mang BCR-ABL b2a2 (32,20%); 26 người mang BCR- ABL b3a2 (44,07%) và 14 ng ười mang dạng kết hợp b2a2 + b3a2 (23,73%). 3.2.2. Hình ảnh mẫu gen bình thường khi khảo sát bằng RT-PCR Hình 2. M u gen c a ng i bình th ng (không có nhi m s c th Philadelphia) Ở hình này chúng ta thấy sự hiện diện của 3 đường chuẩn: S1, S2, và S3. Sự xu ất hiện của GUS (gen bạch cầu của chính bệnh nhân) nói lên quá trình phiên mã ng ược và khuếch đại các bản sao từ phản ứng RT-PCR đã được thực hiện thành công. Không phát hi ện sự hiện diện các bản sao của gen BCR-ABL. 3.2.3. Hình ảnh mẫu gen có chuyển đoạn dạng b2a2 BN.s ố 58. b2a2 = 291.000 copies /ml Hình 3. M u có phát hi n nhi m s c th Philadelphia v i s chuy n o n v trí b2a2 Ở hình 3 ngoài sự hiện diện của 03 đường chuẩn S1, S2, S3 và GUS còn phát hi ện đuợc sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển đoạn ở vị trí b2a2 ch ứng tỏ đây là mẫu máu của bệnh nhân đang mang bệnh Ung thư bạch cầu mạn tính dòng h ạt (CML). 85 3.2.4.Hình ảnh mẫu gen có chuyển đoạn dạng b3a2 BN.s ố:51. b3a2 = 367 copies /ml Hình 4. M u có phát hi n nhi m s c th Philadelphia v i s chuy n o n v trí b3a2 Tương tự như trên, chúng tôi phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia có s ự chuyển đoạn ở vị trí b3a2 ở hình 4. 3.2.5. Hình ảnh mẫu gen có chuyển đoạn dạng kết hợp b2a2+b3a2 BN s ố: 60. b2a2 = 552 copies /ml b3a2 = 195.600 copies /ml Hình 5. M u có phát hi n s chuy n o n c hai v trí b2a2 và b3a2 Trong một số bệnh nhân, qua phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software, chúng tôi th ấy có sự hiện diện sự chuyển đoạn ở cả 02 vị trí b2a2 và b3a2 trên nhi ễm sắc thể Philadelphia. 86 4. Bàn luận 60 b ệnh nhân CML đã được xác định chẩn đoán với tủy đồ dương tính từ phòng thí nghi ệm huyết học bệnh viện Chợ Rẫy và đang được điều trị ngoại trú tại phòng khám huy ết học của bệnh viện. Thuốc sử dụng điều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea), đây là một loại thuốc chống chuyển hoá, tác dụng nhanh, ít độc, ít gây suy tủy (Joanna Gora-Tyborr, 2008) [3]. Tuy nhiên, lo ại thuốc này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn tác nhân chính gây b ệnh là các bản sao của gen tổ hợp BCR-ABL (Joanna Gora-Tybor 2008) [3], điều này giải thích vì sao khi chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR có thể phát hi ện sự hiện diện gen tổ hợp BCR-ABL ở 59/60 bệnh nhân CML (98,33%). Carol D. Jone và CS (2003) [1] c ũng như Susan Branford 2006 [8] cho rằng tỷ lệ này là lớn hơn 95% và nh ư vậy là hoàn toàn tương đồng với kết quả của chúng tôi. Cũng từ những kết qu ả trên chúng ta thấy rằng bệnh Ung thư bạch cầu mạn dòng hạt xuất hiện chủ yếu ở nh ững người đã trưởng thành, đặc biệt ở độ tuổi trung niên (41 – 60) Từ những số liệu nêu trên, chúng tôi cho r ằng, chúng ta có thể hoàn thiện quy trình xét nghiệm để sau đó đem ra áp dụng ở những cơ sở khám và chữa bệnh. Điều này sẽ giúp cho thầy thuốc lâm sàng có m ột phương tiện đáng tin cậy để nhanh chóng xác định chẩn đoán bệnh Ung thư b ạch cầu mãn tính dòng hạt, đồng thời có kế hoạch điều trị cũng như theo dõi đáp ứng điều trị bệnh CML một cách hiệu quả. 5. Kết luận T ừ những kết quả thu được như đã trình bày ở trên chúng tôi nghĩ rằng chúng ta c ần phải nhanh chóng phát triển và ứng dụng các kỹ thuật PCR trong mọi lĩnh vực của đời sống, đặc biệt là trong ngành y để nó thực sự trở thành một công cụ hữu ích giúp cho các th ầy thuốc nhanh chóng xác định chẩn đoán, có kế hoạch điều trị kịp thời để ph ục vụ cộng đồng được hiệu quả hơn. TÀI LI ỆU THAM KHẢO 1. Carol D. Jones, Cecilia Yeung. Comprehensive Validation of a Real-Time Quantitative bcr-abl Assay for Clinical Laboratory Use. Am J Clin Pathol 120, (2003), 42-48. 2. Chomczynski P, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem.Apr; 162(1), (1987), 156-9. 3. Joanna Gora-Tybor. Targeted drugs in Chronic Myeloid Leukemia. Current medicinal Chemistry, 15, (2008), 3036-3051 4. Nowel, PC and D.A Hungerford. Chromosome studies on normal and Leukemic human leucocytes. J Natl Cancer Inst 25, (1960), 85-108 5. Rowley JD. A new consisten chromosomal abnormality in chronic myelogenous 87 leukemia ideltified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 243, (1973), 290-3. 6. Salesse, S. and C., M. Verfaillie. BCR/ABL : from molecular Mechanisms of Leukemia induction to treatment of chronic myelogenous Leukemia.Oncogene 21 (56), (2002), 8547- 59. 7. Sawyers, C.L. Chronic myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine 340(17), (1999), 1330-59. 8. Susan Branford and Timothy Hughes. Diagnosis and Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia by Qualitative and Quantitative RT-PCR. Methods in Molecular Medicine. Vol 125, (2006), 69-92. APPLYING PCR TECHNIQUE IN THE DETECTION OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA Phan Dinh Dien Cho Ray Hospital, HCM City Pham Hung Van, Nguyen Thai Son University of Medicine and Pharmaceutics. HCM City SUMMARY Peripheral blood samples from 60 Chronic Myeloid Leukemia patients were tested by RT-PCR (Reverse Trancription-Polymerase Chain Reaction) and Real-Time PCR to detect Philadelphia chromosome containing BCR-ABL fusion gene. Results show that the BCR-ABL fusion gene was found in 59 (98,33%) of these 60 blood samples. In these 59 positive cases, the b3a2 type has the highest rate of 44,07%, followed by the b2a2 type with 32,2%, and the b2a2 + b3a2 combinative type with 23,73%. These results indicate that PCR technique can be used to detect Philadelphia chromosome. We also compared our results with those in other local and foreign researches to confirm the accuracy of this technique. . CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN UNG TH Ư BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT (CHRONIC. bạch cầu mạn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) là m ột bệnh ác tính của hệ tạo máu với đặc điểm chính là sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt. Trong b ệnh CML có một sự biến đổi nhiễm sắc. sát c ủa các nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới, nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện ở máu ngoại biên và tuỷ xương của bệnh nhân CML là lớn hơn 95% (Carol D. Jone, Cecilia Yeung et al.2003.