TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 78 NGHIÊN CỨU CHUYỂN HOÁ TẠO MUỐI KALI CỦA AXIT HYĐROXY XITRIC TỪ VỎ QUẢ BỨA A RESEACH ON THE CONVERSION OF HYDROXYCITRIC ACID IN RIND FRUITS OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP. EX BENTH. INTO A POTASSIUM SALT FORM. Đặng Quang Vinh, Đào Hùng Cường, Đoàn thị Kim Anh, Huỳnh Sang Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Nguyễn Thưởng Hội Bảo vệ Thiên nhiên và Môi trường Đà Nẵng TÓM TẮT Chuyển hoá tạo muối kali của (-)-HCA dạng tinh thể, bền, có hoạt tính sinh học. Vỏ quả bứa khô được chiết với 300ml methanol bằng phương pháp chưng ninh cách thuỷ trong bình cầu có gắn sinh hàn trong thời gian 3 giờ. Axit (-)-HCA được trung hoà bằng dung dịch KOH, khuấy trộn cẩn thận. Muối kali của HCA được hình thành ở dạng bán rắn màu trắng và khi rửa bằng ethanol chuyển thành dạng sánh như dầu có màu vàng xanh. Lượng muối tạo thành khi chuyển hoá lượng axit trong 100 g mẫu vỏ quả bứa khô là 12,746 g, hiệu suất chuyển hoá tạo muối đạt 86,59%. Đây là kết quả đầu tiên nghiên cứu chuyển hoá (-)-HCA từ bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.). ABSTRACT This study is concerned with the conversion of (-) hydroxycitric acid ((-)-HCA) into its potassium salt form, a stable and biologically active crystal. The dried rind fruits of Garcinia oblogifolia champ. Ex benth are cooked with approximately 300ml of methanol in a refrigeration flask (cooked in a bain-marie) for 3 hours. Next the combined extracts ((-)-HCA) are treated with KOH solution and carefully mixed. Then the white precipitate potassium hydroxycitrate appears in a semi-solid form and finally it changes into a yellow-green oil form after being washed with ethanol. The weight of potassium salt obtained from the conversion of 100g of dried rind fruits amounts to 12.746g, with the conversion ratio of 86.59%. This is the first finding on the conversion of (-)-HCA from dried rind fruits of Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth. 1. Mở đầu Trong một vài năm gần đây, các cấu tử có khối lượng nhỏ và phức tạp được chiết từ nhiều loài bứa (Garcinia Cowa, Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia antroViridis, Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.) trong đó có axit (-) -hyđroxy xitric và lacton của ( -)-HCA (hình 1) có hoạt tính sinh học lý thú đã gây chú ý đối với các nhà hoá sinh, các bác sỹ chuyên COOH C H HO COOH HO C COOH C H H COOH C H COOH HO C C H H C=O O Hình 1. Cấu trúc của (-) axit hydroxy citric và lacton của (-) axit hydroxy citric TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 79 khoa sức khoẻ. Đó là khả năng điều chỉnh quá trình tổng hợp axit béo, sự hình thành lipit, sự ngon miệng và giảm cân. Đồng phân của (-)-HCA đã góp phần trong lĩnh vực dược học như tác nhân có vai trò quan trọng trong việc giảm cân, bảo vệ tim mạch, hiệu chỉnh trạng thái bất bình thường của các lipid và khả năng chịu đựng trong luyện tập thể thao [2], [3], [4]. HCA tồn tại ở hai dạng, dạng ax it tự do và dạng lacton, dạng lacton không có hoạt tính sinh học, dạng axit tự do không bền và bị chuyển thành dạng lacton bền vững nhưng thụ động, không có hoạt tính sinh học [5]. Ngoài ra, (-)-HCA hút ẩm cao trong tự nhiên, điều này gây khó khăn trong việc sấy khô mẫu cũng như bảo quản (- )-HCA tự do. Vì vậy, việc nghiên cứu chuyển hoá tạo muối của (-)-HCA để được sản phẩm có thể kết tinh, ít hút ẩm, bền trong điều kiện tự nhiên là rất cần thiết để ứng dụng sản phẩm này một cách có hiệu quả. Bài báo này trình bày phương pháp chuyển hoá tạo muối kali của (-)-HCA tự do có trong vỏ quả bứa, tạo sản phẩm kết tinh, bền và có hoạt tính sinh học. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu và hoá chất Vỏ quả bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.) khô dùng làm nguyên liệu được thu hái tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP. Đà Nẵng. Tất cả các dung môi và hoá chất sử dụng được cung cấp bởi hãng Merck. Chất chuẩn là ( -)-Calcium threo- hydroxycitrate tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia extract, ∼ 19,5% as Ca, cung cấp bởi hãng Sigma -Aldrich, công thức C 12 H 10 Ca 3 O 16 .xH 2 2.2. Phương pháp nghiên cứu O, khối lượng phân tử 530,43, axit threo-hyđroxy xitric 67,3%. Sử dụng methanol để chiết ( -)-HCA trong vỏ quả bứa khô, dung dịch KOH đậm đặc để trung hoà axit (-)-HCA chuyển hoá tạo muối kali. 2.2.1. Chiết tách axit (-)-HCA Xử lý nguyên liệu: Quả bứa rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ tiến hành sấy khô ở nhiệt độ 80 0 Chiết tách axit (-)-HCA bằng phương pháp chưng ninh: Cân khoảng 100 g mẫu vỏ quả bứa khô dạng bột mịn cho vào bình cầu 1000 ml có gắn sinh hàn chiết chưng ninh (cách thuỷ) với 300 ml methanol, trong thời gian 3 giờ. Lọc dịch chiết bằng giấy lọc, phần xác được chiết lặp lại một lần nữa với 300 ml methanol để tách hết axit, trộn chung dịch chiết và cô đặc dịch chiết về khoảng 100ml, dịch chiết có màu nâu đỏ, trộn dịch chiết với khoảng 40 g than hoạt tính và ngâm trong nước ấm khoảng 30 phút, sau đó lọc chân không dùng phiễu buchne sử dụng giấy lọc, than hoạt tính được rửa lại 02 lần mỗi lần 10 ml methanol để thu hồi hết axit. Dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn. Dịch chiết được cô đặc còn lại 50 ml để thực hiện chuyển hoá tạo muối kali. C, xay nhỏ làm nguyên liệu để chiết tách, chuyển hóa axit (-) - HCA. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 80 2.2.2. Chuyển hoá tạo muối kali của axit (-)-HCA (HCK) Dịch chiết axit (-)-HCA từ vỏ quả bứa được chuyển hoá tạo muối HCK bằng phản ứng trung hoà sử dùng KOH đậm đặc. Khi thêm KOH đậm đặc vào, khuấy trộn cẩn thận, đo lượng KOH sử dụng, khi lượng KOH sử dụng thích hợp sẽ tạo kết tủa tinh thể ở dạng bán rắn xuất hiện trong vòng vài phút, ta có thể lọc và thu phần kết tủa này, khi cho ethanol vào phần kết tủa dạng bán rắn chuyển thành dạng dầu sánh màu vàng xanh. Thực hiện rửa phần kết tủa này bằng ethanol 60%, tiến hành rửa 05 lần mỗi lần với 20 ml để làm sạch hoàn toàn tạp chất. Rửa thêm 02 lần nữa với ethanol tuyệt đối, mỗi lần 50 ml. Dịch rửa lúc đầu đục và các lần sau trong dần, dịch này được gạn lắng và loại bỏ, chất bán rắn không tan có màu vàng chanh, chất bán rắn này sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 70-75 o 2.2.3. Phương pháp trọng lượng C trong vòng 48 giờ trong tủ sấy để loại bỏ hết lượng ethanol còn lại trong sản phẩm. Sản phẩm khô có màu xám nâu là muối kali của ( -)-HCA, nghiền ta thu được dạng bột mịn tinh thể. Cho toàn bộ lượng muối thu được sau khi rửa với ethanol tuyệt đối vào cốc thuỷ tinh đã được sấy khô và biết khối lượng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa muối HCK vào tủ sấy và sấy ở 70-75 o Theo phương trình phản ứng giữa HCA và KOH thì cứ 208g (01 mol) axit (-)- HCA cho 322 g (01 mol) muối HCK. Khối lượng axit (-)-HCA theo phân tích bằng HPLC trong 100g mẫu vỏ quả bứa khô chiết bằng methanol là 9,508 g [1]. Vậy, khối lượng muối tạo thành theo lý thuyết m C. Sau khi sấy khoảng 48 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lượng trên cân phân tích. Dựa vào các kết quả phân tích, ta tính được khối lượng muối HCK. 0 2.2.4. Kiểm tra sản phẩm HCK tạo thành bằng quang phổ (IR), sắc ký lỏng cao áp (HPLC), quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) = 14,719 g. Từ khối lượng lý thuyết và kết quả HCK hình thành thực tế ta có thể tính toán hiệu suất của quá trình chuyển hoá. - Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ (IR): Thực hiện chụp phổ IR của sản phẩm HCK và muối (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate chuẩn, xác định cấu trúc của HCK và độ trùng lặp so với chuẩn. - Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): Xác định thành phần HCK trong sản phẩm muối chuyển hoá dựa vào diện tích pic và thời gian lưu so với chuẩn. - Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS): Xác định thành phần kim loại nặng và kali có trong sản phẩm muối HCK chuyển hoá theo TCVN 6193-1996. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 81 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng KOH đậm đặc đến quá trình chuyển hoá tạo muối kali của HCA Để đánh giá, khảo sát sự ảnh hưởng của lượng KOH đến quá trình chuyển hoá tạo muối HCK, ta tiến hành thử ở 5 mẫu dịch chiết cùng một lúc trung hoà với KOH đậm đặc khuấy trộn cẩn thận, dùng buret để định lượng KOH đậm đặc sử dụng. Lượng KOH đậm đặc được sử dụng trong 5 mẫu tương ứng như sau: mẫu 1: 7,4 ml; mẫu 2: 9,0 ml; mẫu 3: 9,9 ml; mẫu 4: 11 ml; mẫu 5: 12,06 ml. Kết quả quan sát cho thấy: mẫu 1 không có hiện tượng, mẫu 2 và mẫu 3 xuất hiện kết tủa dạng tinh thể ở thể vấn màu trắng lơ lửng; mẫu 4 có màu nâu đậm và xuất hiện lớp dầu nằm phía dưới; mẫu 5 có màu nâu nhạc hơn và không có lớp dầu là dung dịch đồng nhất. Khi cho ethanol vào thì: mẫu 1 có xuất hiện lớp dầu có màu trắng xanh; mẫu 2 và 3: các thể vấn tan và tạo lớp dầu sánh có màu vàng xanh; mẫu 4: dung dịch vẫn phân lớp và có màu nâu đậm; mẫu 5: không có hiện tượng xảy ra. Mẫu dầu có màu vàng xanh của mẫu 1, 2, 3 sấy khô trong tủ sấy thành dạng tinh thể đó là muối HCK; mẫu dầu của mẫu 4 sấy không khô và tồn tại ở dạng pass như bạch nha. 3.2. Hiệu suất tạo muối HCK: Để xác định hiệu suất tạo muối HCK từ vỏ quả bứa khô, ta thực hiện chuyển hoá 03 mẫu với khối lượng vỏ quả bứa khô khoảng 100g. Khối lượng muối HCK tạo thành được thể hiện qua bảng 1 như sau: Bảng 1. Kết quả khối lượng muối kali hidroxy citrat tạo được Ký hiệu mẫu Khối lượng mẫu (g) Lượng KOH sử dụng (ml) Khối lượng muối tạo thành (g) M 1 100 9,4 12,662 M 2 100 9,0 12,756 M 3 100 9,9 12,820 Khối lượng muối HCK ở dạng rắn tinh thể tạo thành trung bình là 12,746g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối vào khoảng 86,02 – 87,09%. 3.3. Kiểm tra sản phẩm bằng phổ hồng ngoại (IR), HPLC và AAS 3.3.1. Kiểm tra sản phẩm muối HCK bằng phổ hồng ngoại IR Để kiểm tra sản phẩm muối HCK tạo thành ta thực hiện chụp phổ hồng ngoại IR, so với phổ hồng ngoại của canxi hyđroxycitrat chuẩn. Kết quả kiểm tra bằng phổ IR thể hiện ở hình 2, 3 dưới đây: TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 82 Hình 2. Phổ IR của muối HCK Hình 3. Phổ IR muối canxi hydroxycitrat chuẩn Kết quả chụp phổ IR của muối kali hydroxycitrat tạo thành (hình 2) và muối canxi hydroxycitrat (HCCa) chuẩn (hình 3) cho thấy xuất hiện píc lần lược có bước sóng 3385,73cm -1 , 3400,11cm -1 ứng với phổ dao của nhóm –OH và có píc ứng với bước sóng 1592,53 cm -1 , 1599,04 cm -1 ứng với nhóm C=O trong nhóm –COOK và (- COO) 2 3.3.2. Kiểm tra sản phẩm muối HCK bằng HPLC Ca. Về hình dáng phổ IR của muối HCK và HCCa chuẩn tương tự nhau. Để kiểm tra sản phẩm muối tạo thành ta thực hiện kiểm tra sản phẩm muối HCK thu được bằng phổ HPLC, so sánh với phổ HPLC của (-)-HCA chuẩn. Kết quả kiểm tra bằng phổ HPLC thể hiện ở hình dưới đây: Hình 4. Phổ HPLC của sản phẩm muối HCK Hình 5. Phổ HPLC của (-)-HCA chuẩn Kết quả chụp phổ HPLC của muối HCK (hình 4) xuất hiện pic có thời gian lưu là 3,70 phút, trùng với thời gian lưu của (-)-HCA chuẩn (hình 5) là 3,77 phút. Cũng theo kết quả chạy phổ HPLC của muối HCK tạo thành ta thu được 04 pic với thời gian lưu khác nhau, pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của ( -)-HCA chuẩn cao nhất và có diện tích lớn nhất chiếm 77,021%. Kết quả diện tích của từng pic thể hiện ở bảng 2 như sau: TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 83 Bảng 2. Kết quả diện tích pic trên phổ HPLC của sản phẩm muối HCK TT Thời gian lưu (RT) Diện tích pic % diện tích pic Tên 1 2,25 7325 12,588 2 2,82 2227 3,827 3 3,70 44822 77,021 HCK 4 7,11 3819 6,564 Tổng cộng 58193 100,000 Hàm lượng muối HCK trong sản phẩm chuyển hoá là 77,021%, ứng với thời gian lưu là 3,70 phút. 3.3.3. Kiểm tra hàm lượng kali và các kim loại nặng trong sản phẩm muối HCK Tiến hành kiểm tra hàm lượng kali và các kim loại nặng khác có trong sản phẩm muối HCK tạo thành bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). Kết quả xác định K, As, Cu, Pb, Zn, Fe, Sn trong muối HCK tạo thành được thể hiện ở bảng 3 dưới đây: Bảng 3. Kết quả xác định thành phần kim loại nặng trong sản phẩm HCK TT Tên kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (*) (mg/kg) 1 Pb TCVN 6193-1996 Kph 2 2 Cu TCVN 6193-1996 8,5 30 3 Zn TCVN 6193-1996 40 40 4 Fe TCVN 6193-1996 Kph - 5 Sn TCVN 6193-1996 0,14 40 6 As TCVN 6193-1996 0,129 1 7 Kali TCVN 6193-1996 320.000 - Ghi chú: Kph: không phát hiện; “ -“: không quy định; (*) Thành phần kim loại nặng trong sản phẩm muối HCK tạo thành nằm trong giới hạn cho phép của Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm, có thể sử dụng sản phẩm HCK tạo thành để làm thực phẩm hoặc dược phẩm mà không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Kết quả xác định hàm lượng kali trong sản phẩm muối HCK bằng phương pháp AAS là 320.000 mg/kg (chiếm 32%). Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 84 4. Kết luận Đã khảo sát và xây dựng quy trình chuyển hoá tạo muối kali của (-)-HCA thích hợp. Điều kiện chuyển hoá tạo muối kali thích hợp là sử dụng 7,4 – 9,9 ml KOH đậm đặc/100ml dung dịch chiết v à dung môi chiết là methanol. Khối lượng muối kali hidroxy citrat thu được khi chuyển hoá 100g nguyên liệu mẫu vỏ quả bứa khô trung bình là 12,746g/100g mẫu, đạt hiệu suất 86,02 – 87,09%. Hàm lượng HCK trong sản phẩm chiếm 77,021%, lượng kim loại kali chiếm 32% và các kim loại nặng khác nằm trong giới hạn cho phép của tiêu chuẩn dùng cho thực phẩm. Từ kết quả này có thể tiếp tục nghiên cứu sâu để sản xuất thực phẩm chữa trị béo phì từ cây bứa Việt nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đào Hùng Cường, Đặng Quang Vinh, “Xác định axit hữu cơ từ lá, vỏ quả bứa bằng sắc ký lỏng cao áp”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 3 (20), tr 137-143, 2007. [2] Bhabani S. Jena, Guddadarangavvanahally. Jayaprakasha, Kunnumpurath K. Sakariah*, "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa", Journal of Agricultural and Food chemistry, Vol 50, No. 12, 2002. [3] Jayaprakasha GK, Sakariah KK. (Apr 15), "Determination of organic acids in leaves and rinds of Garcinia indica (Desr.) by LC", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28(2):379-84, 2002. [4] Jena BS, Jayaprakasha GK, Singh RP, Sakariah KK. (Jan 2), "Chemistry and biochemistry of (-)-hydroxycitric acid from Garcinia", Journal of Agricultural and Food chemistry, 50(1):10-22, 2002. [5] Muhammed Majeed, Vladimir Badmaev, Ramaswamy Rajendran, “Process for the production of posstasium hydroxy citric acid and compositions containing the posstasium hydroxy citric acid”, Patent No. US 6,770,782 B1, 2004. . Lượng muối tạo thành khi chuyển hoá lượng axit trong 100 g mẫu vỏ quả bứa khô là 12,746 g, hiệu suất chuyển hoá tạo muối đạt 86,59%. Đây là kết quả đầu tiên nghiên cứu chuyển hoá (-)-HCA từ bứa. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 78 NGHIÊN CỨU CHUYỂN HOÁ TẠO MUỐI KALI CỦA AXIT HYĐROXY XITRIC TỪ VỎ QUẢ BỨA A RESEACH ON THE CONVERSION. tách, chuyển hóa axit (-) - HCA. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 6(35).2009 80 2.2.2. Chuyển hoá tạo muối kali của axit (-)-HCA (HCK) Dịch chiết axit (-)-HCA từ vỏ quả