BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– LÊ VĂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI TRONG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN TẠI BẮC GIANG, BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN, NĂM 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– LÊ VĂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI TRONG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN TẠI BẮC GIANG, BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ Chuyên ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học Thú y Mã số: 62 64 01 04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Tập thể hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên 2. PGS.TS. Cù Hữu Phú Thái Nguyên, năm 2013 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn chính xác và đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 7 năm 2013 Tác giả NCS. Lê Văn Dƣơng ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiểu tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, Ban quản lý Sau đại học Đại học Thái Nguyên, phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Bộ môn Vi trùng, Bộ môn Virus-Viện Thú y Quốc gia và Chi cục Thú y tỉnh Bắc Giang đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học là GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên phó Viện trưởng-Viện Khoa học sự sống- Đại học Thái Nguyên và PGS.TS. Cù Hữu Phú trưởng Bộ môn Vi trùng-Viện Thú y Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo-Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ, chia sẻ những ý kiến quý báu, hướng dẫn tôi thực hiện thí nghiệm để hoàn thiện đề tài nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các học viên cao học, các em sinh viên đã đóng góp công sức, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn./. Thái Nguyên, tháng 7 năm 2013 Tác giả NCS. Lê Văn Dƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lƣợc nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS) ở lợn 4 1.1.1. Cấu trúc virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) ở lợn và các đặc tính sinh học 4 1.1.2. Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus 6 1.1.3. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 7 1.2. Vai trò của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 9 1.2.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn 10 1.2.2. Vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P. multocida gây ra 23 1.2.3. Vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra 31 Chƣơng 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Nội dung nghiên cứu 40 2.1.1. Tình hình dịch PRRS ở lợn và kết quả chẩn đoán tại tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 40 2.1.2. Phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis ở mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang 40 2.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 40 iv 2.1.4. Nghiên cứu biện pháp phòng, trị 40 2.2. Đối tƣợng, nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 41 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 41 2.2.2. Nguyên vật liệu 41 2.2.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 42 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 42 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu 43 2.3.3. Phương pháp xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV và phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis 43 2.3.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis 44 2.3.5. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis 44 2.3.6. Phương pháp tính LD 50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trên chuột bạch 48 2.3.7. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 49 2.3.8. Phương pháp xác định độc lực trên động vật thí nghiệm 49 2.3.9. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 49 2.3.10. Xây dựng phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS 50 2.3.11. Phương pháp chế tạo Autovaccine thử nghiệm từ các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 51 2.3.12. Phương pháp xử lý số liệu 53 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 54 3.1. Tình hình dịch PRRS ở lợn và kết quả chẩn đoán tại tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 54 3.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 54 v 3.1.2. Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS ở các loại lợn 58 3.1.3. Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS theo mùa vụ 60 3.1.4. Kết quả tổng hợp triệu chứng, bệnh tích chủ yếu ở lợn mắc PRRS và xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang 62 3.2. Kết quả phân lập A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis ở lợn dƣơng tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang 64 3.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập đƣợc 68 3.3.1. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 69 3.3.2. Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 77 3.3.3. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 84 3.3.4. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được 90 3.4. Kết quả nghiên cứu biện pháp phòng, trị 96 3.4.1. Kết quả chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn 97 3.4.2. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của Autovaccine ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang 107 3.4.3. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS 118 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 121 1. Kết luận 121 2. Đề nghị 122 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123 TÀI I LIỆ U THAM KHẢ O 124 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADN : Acid Deoxyribonucleic AGID : Agargel Immuno Diffuse A. pleuropneumoniae : Actinobaccillus pleuroneumoniae Apx : Apx - Toxins BHI : Brain Heart Infusion Bp : Base pair CAMP : Chiristie - Atkinson - Munch - Peterson CFU : Colony Forming Unit CPS : Capsule polysaccharide Cs : Cộng sự DNT : Dermanecrotic toxin ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay H. pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae HIP : Acid hippuric IHA : Indirect Haemagglutination test LPS : Lypopolysaccaride LD : Lethal dose MR : Methyl red NAD : Nicotinamide Adenine Dinucleotide OMPs : Outer membrane proteins PBS : Phosphat buffer solution PCR : Polymerase Chain Reaction PPLO : Pleuropneumonia - like organism P. multocida : Pasteurella multocida PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RR : Relative Risk Sta. aureus : Staphylococcus aureus S. suis : Streptococcus suis TYE : Tryptone Yeast Extract Broth TSA : Tryptic Soya Agar TSB : Tryptone soya broth VP : Voges Prokauer YE : Yeast Extract vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, B, D của vi khuẩn P. multocida 45 Bảng 2.2: Trình tự các mồi dùng để xác định các gen mã hoá các cps 47 Bảng 2.3: Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định serotype và một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis 47 Bảng 2.4: Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định serotype và một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis 48 Bảng 2.5: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) 50 Bảng 2.6: Thí nghiệm kiểm tra an toàn của Autovaccine trên chuột bạch 52 Bảng 3.1: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc PRRS và tử vong tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 55 Bảng 3.2: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS ở các loại lợn 58 Bảng 3.3: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS theo mùa vụ 60 Bảng 3.4: Kết quả tổng hợp triệu chứng, bệnh tích chủ yếu ở lợn mắc PRRS và xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV 63 Bảng 3.5: Kết quả phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis ở mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV 67 Bảng 3.6: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được 70 Bảng 3.7: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được 72 Bảng 3.8: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được 74 Bảng 3.9: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được bằng hệ thống API 20 Strep 76 Bảng 3.10: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được bằng phản ứng AGID 77 viii Bảng 3.11: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản ứng PCR 79 Bảng 3.12: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được 82 Bảng 3.13: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được 85 Bảng 3.14: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được 87 Bảng 3.15: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được 89 Bảng 3.16: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được 91 Bảng 3.17: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được 93 Bảng 3.18: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được 94 Bảng 3.19: Kết quả tổng hợp khả năng mẫn cảm mạnh và kháng với các kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis 95 Bảng 3.20: Các chủng vi khuẩn được chọn để chế tạo Autovaccine 97 Bảng 3.21: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng chế tạo Autovaccine 99 Bảng 3.22: Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng sử dụng chế tạo Autovaccine 100 Bảng 3.23: Kết quả kiểm tra vô trùng 3 lô Autovaccine chế tạo thử nghiệm 101 Bảng 3.24: Kết quả kiểm tra an toàn của Autovaccine trên chuột bạch 102 Bảng 3.25: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn A. pleuropneumoniae 103 Bảng 3.26: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn P. multocida 104 [...]... sinh học của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis gây vi m phổi trong Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn tại Bắc Giang, biện pháp phòng trị” * MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây vi m phổi ở lợn mắc PRRS - Nghiên cứu chế tạo Autovaccine phòng bệnh vi m phổi cho lợn từ... chủng A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được - Đề xuất và thử nghiệm các phác đồ điều trị lợn nghi mắc vi m phổi và PRRS có hiệu quả * Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Là công trình nghiên cứu có hệ thống về đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây bệnh vi m phổi ghép ở lợn mắc PRRS - Nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng vi khuẩn. .. (2011) [10], bệnh tích đặc trưng nhất là vi m phổi kẽ và vi m hạch lâm ba ở cả 2 dạng (PRRS dạng cổ điển và PRRS dạng sốt cao) Vi m phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám đặc chắc (nhục hóa) trên các thùy phổi Thùy phổi bị vi m có màu đỏ xám, có mủ và đặc chắc Trên mặt cắt ngang của thùy bị vi m lồi ra, khô Nhiều trường hợp lợn mắc bệnh bị vi m phế quản phổi hóa mủ ở mặt dưới thùy đỉnh *... nghiên cứu cụ thể Để làm rõ mối quan hệ giữa các vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A pleuropneumoniae), Pasteurella multocida 2 (P multocida), Streptococcus suis (S suis) gây bệnh ghép với PRRS và làm cơ sở khoa học cho vi c xây dựng các biện pháp phòng, chống PRRS và bệnh vi m phổi ở lợn do các vi khuẩn ghép với PRRS, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học. .. pleuropneumoniae và bệnh vi m phổi - màng phổi ở lợn 1.2.1.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae * Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh vi m phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn Utrera và... các phác đồ điều trị lợn nghi mắc vi m phổi và PRRS đạt hiệu quả cao 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC NGHIÊN CỨU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS) Ở LỢN 1.1.1 Cấu trúc virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) ở lợn và các đặc tính sinh học Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn do virus thuộc họ Arteriviridae, giống Nidovirales có cấu trúc dạng chuỗi đơn ARN... cho lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang đã góp phần giảm trầm trọng dịch PRRS, giảm tỷ lệ lợn mắc vi m phổi do vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây ra 3 - Sử dụng phác đồ điều trị lợn nghi mắc vi m phổi và PRRS có hiệu quả cao góp phần nâng cao số lượng và chất lượng đàn lợn nuôi tại Bắc Giang - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để xây dựng các biện pháp phòng, trị bệnh cho lợn. .. trò của vi khuẩn kế phát là một trong những nguyên nhân quan trọng gây chết hàng loạt lợn tại các địa phương xảy ra dịch hiện nay Do PRRSV với đích tấn công phá hủy đại thực bào, làm suy giảm miễn dịch, dẫn đến các mầm bệnh nhiễm trùng thứ phát có cơ hội trỗi dậy gây bệnh cho lợn Trong đó, một số loại vi khuẩn thường gây bệnh vi m phổi ở lợn như A pleuropneumoniae, P multocida và S suis 10 1.2.1 Vi khuẩn. .. MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Làm rõ vai trò gây vi m phổi của các vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis ở lợn mắc PRRS - Autovaccine chế tạo từ các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được có hiệu quả phòng bệnh vi m phổi cho lợn, làm giảm trầm trọng dịch PRRS và được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại tỉnh Bắc Giang - Xác định được các phác đồ điều trị lợn nghi mắc vi m... trường hợp lợn bị vi m hai bên phổi với tổn thương ở các thùy đỉnh, thùy tim và một phần các thùy trên vòm hoành Vi m màng phổi tơ huyết và fibrin thường rất rõ ở những 21 lợn chết trong giai đoạn cấp tính của bệnh Hầu hết những nghiên cứu đều kết luận rằng những tổn thương trên là do độc tố của vi khuẩn A pleuropneumoniae gây ra (Bertram, 1986) [54] Ở các trường hợp tử vong nhanh chóng như thể cấp tính . tháng 7 năm 2013 Tác giả NCS. Lê Văn Dƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC. Forming Unit CPS : Capsule polysaccharide Cs : Cộng sự DNT : Dermanecrotic toxin ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay H. pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae HIP : Acid. mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Lợn mang