3.1: Cơ sở lý luận của phương pháp cố định tiêu bản và nhuộm tế bào: Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi quang học là phương pháp không thể thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn.  Thành tế bào (Cell wall) Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm Gram dương là 14-18 nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi.  Nồng độ đường muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10-20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ. Thành tế bào vi khuẩn G- và G+ có sự sai khác về thành phần cấu tạo như sau: Thành phần Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn thành tế bào vi khuẩn G+ G+ G- G- Peptidoglycan Peptidoglycan Acidteicoic Acidteicoic Lipid Lipid Protein Protein 30-95 30-95 Có Có Hầu như không Hầu như không O hoặc ít O hoặc ít 5-20 5-20 0 0 20 20 Cao Cao Vách vi khuẩn Gram dương có thành phần cấu tạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn gọi là glucopeptit, murein, chiếm 95 % trọng lượng khô của thành, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N- acetylglucozamin, N- acetylmuramic và galactozamin. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương chứa PG đầy đủ 4 lớp (chiếm >50% trọng lượng khô của thành). Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào.  Vách vi khuẩn Gram âm có thành tế bào với cấu trúc phức tạp, ngoài cùng là 2 lớp lipopolysaccharit có đan xen với các phân tử protein. Các protein này đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác. Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào (thuốc nhuộm, chất kháng sinh, muối kim loại nặng, một số enzym phân giải…)  Tính chất nhuộm màu của vsv là khả năng của chúng có thể giữ lại các chất có màu (thuốc nhuộm). Tính chất đó có mối liên hệ chặt chẽ với thành phần hoá học và các tính chất hoá-lý. Màu và khả năng của các chất nhuộm (chromogene) được xác định bởi các nhóm hữu cơ trong phân tử của nó. Các nhóm này tham gia vào các mối liên kết hoá học với các gốc khác nhau trong thành phần hoá học của vsv và được giữ lại, biến đổi màu của vsv. Các chromogene khi phân cực và tạo thành các cation hay anion có màu. Trong thực tế vsv học người ta sử dụng fucsin, Crystal violet, Xanh metylen… tham gia nhuộm màu là các nhóm amin. Trong các thuốc nhuộm khác, tính chất này được thực hiện bởi các nhóm OH-  Khi vsv có chứa các phức chất của protein, nucleoproteid có tính acid, vsv bắt màu mạnh với thuốc nhuộm có tính kiềm. Chính vì vậy, vsv trong giai đoạn phát triển, với hàm lượng nucleoproteid cao rất dễ bắt màu.  Các tế bào sống bắt màu yếu, vì các dung dịch có màu khó đi qua thành tế bào. Đó là lý do tại sao người ta thường tiêu diệt vsv và cố định tiêu bản bằng nhiệt hoặc hoá chất.  Các bào tử của vsv, đặc biệt là của một số vi khuẩn rất khó nhuộm màu. Người ta phải nung nóng tiêu bản và sử dụng thuốc nhuộm ở nồng độ cao (đậm đặc hơn).  Nguyên tắc nhuộm Gram : - Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. - Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. - Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.  3.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vsv có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu bản. Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có [...]... bôi vi khuẩn Nhuộm bằng dung dịch acid tannic trong 5 phút, rửa nước Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 3-5 phút, rửa nước, thấm khô Soi kính: dùng vật kính dầu 100´ Kết quả: Thành tế bào bắt màu tím, tế bào chất màu tím nhạt Các phương pháp định lượng vi khuẩn 3.2 Phương pháp đếm Có rất nhiều phương pháp đếm số lượng vi khuẩn, tùy theo mục đích, phương tiện, tùy loài vsv mà có thể sử dụng các phương. .. được tế bào vi khuẩn sống và tế bào vi khuẩn chết Hơn nữa tế bào vi khuẩn rất bé nên vi c đếm dưới kính hiển vi là không dễ dàng (Phương pháp này chủ yếu áp dụng cho những tế bào không cần nhuộm màu) Đếm vi khuẩn đã nhuộm: Nhỏ một thể tích nhất định của huyền phù muốn đếm lên một diện tích nhất định trên phiến kính, cố định và nhuộm màu, thường là với xanh metylen hoặc với màu phù hợp với vi khuẩn ấy... một giọt huyền phù chứa vi khuẩn muốn đếm, đậy lá kính lại khi đó ta có thể tích mỗi ô nhỏ là: 1/10 x 1/20 x 1/20mm3=1/4000mm3  Gọi độ pha loãng của dung dịch vi khuẩn cần đếm là K, trung bình số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ là A (ta đếm vài ô lớn, sau đó lấy trung bình số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ), khi đó số vi khuẩn có trong 1ml dung dịch là N:  N=A x 4 x 106 x K (số tế bào/1ml)  Phương pháp này cho kết... 10-3 1ml Đọc kết quả Đem ủ - Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most Probable Number): Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong... tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu Qui trình MPN cho giá trị số lượng vi sinh vật trong mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật trong mẫu khi sử dụng một số lần lặp lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn Phương pháp MPN để định lượng vi sinh vật cho đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến hành qui trình dễ dàng... phân biệt Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường và nồng độ nuôi cấy cũng được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh vật hay phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với các đặc điểm mong muốn, rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng có thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó theo định nghĩa cụ thể... =4.5 1.2 3 Sử dụng màng lọc vi khuẩn Trường hợp dung dịch cần đếm có mật độ vi khuẩn thấp như kiểm tra vi khuẩn có trong bia, các loại nước uống Cho một lượng lớn dung dịch cần kiểm tra qua màng lọc sau đó đặt màng lọc lên nuôi cấy trên đĩa thạch, căn cứ vào lượng dung dịch đem lọc và số khuẩn lạc trên mỗi màng lọc ta suy ra số lượng vi khuẩn có trong một đơn vị thể tích Phương pháp này cho chúng ta... gần đúng, chứ không cho số chính xác Phương pháp này cho phép đếm số tế bào sống, không đếm được tế bào chết, sai số thường lớn, do đó phải thực hiện hai ba lần và lấy trị số trung bình, để giảm bớt sai số  4 Phương pháp đo độ đục của huyền phù vi khuẩn Đo bằng quang phổ kế Nguyên tắc: Dùng chùm tia sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa vi sinh vật muốn đo, vi sinh vật làm phân tán bớt chùm tia... Sau đó, đếm số lượng tế bào trên một đơn vị diện tích  2 Đếm số tế bào sống (khuẩn lạc trên đĩa thạch)  Phương pháp pha loãng  Dùng dung dịch cần đếm vi khuẩn pha loãng ở các độ liên tiếp nhau, theo cơ số 10, thông thường lấy vi khuẩn đã pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp thích hợp với từng loại vi khuẩn Đảm bảo có thể đếm được khuẩn lạc, ít nhất là có hai ống có thể nhìn thấy khuẩn lạc  Đếm số khuẩn... chất con số MPN biểu diển số lượng vi sinh vật trong mẫu là số lượng trung bình sau các lần lặp lại Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu lớn thì sự khác biệt của các mẫu giữa các lần lặp lại là nhỏ, kết quả riêng lẻ của tất cả các lần lặp gần với kết quả trung bình Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, sự khác biệt này sẽ lớn Nếu trong một mẫu chất lỏng chứa 100 vi sinh vật/100 ml, thì trong 10 ml . sở lý luận của phương pháp cố định tiêu bản và nhuộm tế bào: Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi quang học là phương pháp không thể thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn.  Thành. vật có phức chất này thuộc loại gram âm.  3.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vsv. được nhuộm. Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loại thuốc nhuộm thường dùng là methylene blue, crystal violet, fuchsin  +Phương pháp nhuộm Gram Đầu