Đang tải... (xem toàn văn)
A. ĐẶT VẤN ĐỀ: Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Nhờ đó mà người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng có năng suất cao, chống chịu với sâu bệnh, mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền ... Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao, do việc phải cấy chuyển, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới có thể tự động hóa. Năm 1981, Taykayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có thể sục khí chủ động từ ngoài vào. Trong đó có ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreacter, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào. Nuôi cấy Bioreacter là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với só lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi...), và sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng sử dụng tế bào thực vật. B. NỘI
Thành viên nhóm 7: STT Họ và tên MSV Lớp 1 Nguyễn Thị Duyên 570960 K57CNSHC 2 Nguyễn Thị Anh Đào 560785 K56CNSHA 3 Phạm Thị Huệ 560808 K56CNSHA 4 Lê Ngọc Mai 560827 K56CNSHA 5 Phùng Tiến Quang 560853 K56CNSHA 6 Phạm Thị Thảo 560866 K56CNSHA 7 Đào Trần Trung 550413 K55CNSHA 8 An Thị Yến 560895 K56CNSHA A. ĐẶT VẤN ĐỀ: Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Nhờ đó mà người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng có năng suất cao, chống chịu với sâu bệnh, mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao, do việc phải cấy chuyển, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới có thể tự động hóa. Năm 1981, Taykayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có thể sục khí chủ động từ ngoài vào. Trong đó có ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreacter, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào. Nuôi cấy Bioreacter là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với só lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi ), và sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng sử dụng tế bào thực vật. B. NỘI DUNG I. Giới thiệu chung: 1. Khái niệm chung: Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy. Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Ở đó chúng sinh trưởng,phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào. Điều kiện quan trọng của nuôi cấy huyền phù tế là môi trường nuôi cấy được khuấy lắc liên tục với tốc độ 100- 150 vòng/phút. Các mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa 2.4D là nguồn nguyên liệu thích hợp để tạo huyền phù tế bào và để nhận được 100ml huyền phù tế bào thường cần 2-3g mô callus tươi. Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. 2. Đặc trưng cuả tế bào nuôi cấy huyền phù: - Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2-3g/100ml dung dich môi trường (helgeson, 1979). Theo King và street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào. - Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi thành phần môi trường. VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp. - Chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù: có dạng đường cong chữ S với các pha sinh trưởng sau: +Pha tiềm sinh (Lag-phase): ở pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và số lượng tế bào (A). +Pha số mũ (Exponential phase): ở pha này sự phân chia và sự tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất. Ngoài ra sự sinh trưởng tế bào cũng tăng nhanh (B). +Pha tuyến tính (Linear log-phase): được đặc trưng bởi sự sinh trưởng của tế bào diễn ra ổn định liên tục (C). +Pha ổn định: ở pha này hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định (Stationary phase-D). +Pha suy thoái (Dead phase): sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển (E). - Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất. Sự kết tập của tế bào là lớn nhất trong khoảng 18-25 ngày, với huyền phù sinh trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ 6-9 ngày. Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn. Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm báo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ không sinh trưởng được. VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acerpseudoplatanus) mật độ thích hợp 9-15.10 3 tb/ml. - Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy,sinh trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào, có đặc điểm sau: + Khả năng tách tế bào cao. +Hình thái tế bào đồng nhất. + Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc. + Nhiều hạt tinh bột. + Tương đối ít các yếu tố mạch. + Có khả năng nhân đôi trong 24-72h. + Mất tính toàn năng. + Quen với chất sinh trưởng. + Tăng mức đa bội thể. 3. Môi trường nuôi cấy: Về bản chất các tế bào huyền phù là loại tế bào callus, do đó môi trường nuôi cấy calus có thể sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào với việc cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có được các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc. Huyền phù tế bào được duy trì bằng sự cấy chuyển liên tục ở đầu pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất. 4. Các chỉ tiêu sinh trưởng: - Số lượng tế bào: Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút. Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy. - Thể tích tế bào: Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. Thu tế bào và đem xác định thể tích. Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy. - Khối lượng tươi: Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định. Rửa bằng nước cất vô trùng Làm khô trong chân không. Cân để xác định khối lượng. - Khối lượng khô: Lấy một thể tích mẫu xác định. Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman. Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi. - Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào): Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào. Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân. Tổng số tế bào phân bào x 100 Chỉ số phân bào(%) = Tổng số tế bào kiểm tra - Khả năng sống của tế bào: nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và quan sát màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet). II. Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào 1. Nuôi cấy dịch thể động : 1.1. Nuôi cấy chìm liên tục : - Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường. Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng. Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau. - Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25ml, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút. - Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình. Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày. - Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được cấy chuyển sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào. 1.2. Nuôi cấy chìm tuần hoàn : Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với những khoảng thời gian được đưa ra ngoài môi trường.Quá trình được thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của các bình nuôi cấy. Khi chuyển động: Khối tế bào ở đầu này được đưa vào môi trường. Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí. 2. Nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor: Hệ thống Bioreacter có rất nhiều nhưng phổ biến nhất là hệ thống Bioreacter kiểu Air-lift và hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời. II.1. Cấu tạo chung: Chứa các thành phần như bộ điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (một só thiết bị được thay bằng bộ sục khí nén từ dưới lên ). Nguyên tắc hoạt động của từng thiết bị phụ thuộc vào từng công nghệ sản xuất. II.2. Bioreacter không có cánh khuấy: Đây là kiểu Bioreacter đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có tác dụng khuấy trộn môi trường và cung cấp oxy, lượng oxy cung cấp ảnh hưởng đến sự phát triển của đối tượng. Dòng khí vào pha lỏng phải được thổi qua một màng lọc có các lỗ kích thước nhỏ 0.01 – 0.1mm. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm giảm đáng kể sự cọ xát cho các tế bào nên tế bào ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có nhạy cảm cao. - Ưu điểm: +Khả năng nhân sinh khối rất nhanh, chồi phát triển tương đối đồng đều. +Hệ thống này rất phù hợp cho những quá trình nhân sinh khối tế bào và nhân sinh khối rễ do khả năng chịu được sự ngập chìm trong môi trường. +Thực tế hiện nay người ta đang sử dụng hệ thống này vào sản xuất giống hay sinh khối như nuôi củ hoa Lily, hoa thu Hải đường hay nhân sâm của phân viện sinh học Đà Lạt. - Khuyết điểm: + Sự cung cấp Oxy không được đồng đều trong toàn bộ môi trường. + Hiện tượng thủy tinh thể do ngập chìm hoàn toàn và liên tục. + Khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau. + Nuôi cấy trong môi trường lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, côn trùng II.3. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS): II.3.1. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống: Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: - Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy. - Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ. - Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ. - Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động. - Hạn chế sự nhiễm. - Giá thành hạ. Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường. Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau: - Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại. - Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập. - Hệ thống ống dẫn và van điều khiển. - Các màng lọc. - Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh. Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau. Ở nước ta, Phân viện Sinh học Đà Lạt đã chế tạo thành công hệ thống nuôi cấy này và đã thành công trong việc nhân giống nhanh loài hoa African violet. [...]... của nuôi cấy huyền phù tế bào trong nhân giống vô tính - Quy trình nuôi cấy: Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thường qua hai bước cơ bản là nuôi cấy callus và nuôi cấy dịch huyền phù: - Nuôi cấy callus: Callus là dòng tế bào ban đầu, tương tự mô sẹo tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi trường thạch mềm vì nuôi cấy huyền phù tế bào. .. trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách... thí nghiệm, các nhà khoa học tiếp tục triển khai các phòng sinh khối tế bào thực vật Từ đó sử dụng các kỹ thuật chiết tách để thu nhận các hợp chất cần thiết Nuôi cấy huyền phù tế bào đang mở ra nhiều định hướng phát triển cho tương lai Tuy nhiên, do cơ sở vật chất cơ bản cho một phòng thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào còn cao nên ở Việt Nam, hướng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ dừng lại ở mức nghiên... của tế bào xảy ra m3 VI KẾT LUẬN Với nhiều ưu điểm vượt trội của mình, phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu cũng như trong thực tiễn sản xuất Khi tìm được điều kiện thích hợp, các nhà khoa học có thể phát triển quy mô nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy sinh học Bioreactor có dung tích khác nhau Sau khi nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trong... nguồn của hai hợp chất rất quan trọng trong y học là morphine và codein Sản xuất morphin đã được thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào tế bào cây anh túc - Steviol: Có trong Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana), là chất tạo vị ngọt được biết đến rộng rãi Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong tích lũy steviol.Trong nuôi cấy callus, hiệu suất đạt tới 36.4 % - Taxol:... 90-100 vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ 28-30oC, với ánh sáng 3000 lux, cứ khoảng 2-3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra bằng cách đếm đưới kính hiển vi, xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào - Sau 1-2 tuần trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào : + Tế bào có khả năng sinh phôi + Tế bào không có khả năng sinh phôi - Sau 8 ngày sẽ thu được sinh khối, chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá trình nuôi kế tiếp, dung... mô sẹo khá lớn - Nuôi cấy dịch huyền phù: Callus được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy Đây là giai đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính chất quyết định thành công của quá trình nuôi cấy tế bào Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần... tháng mà không cần cấy chuyền Điều quan trọng là chồi thu được trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm có chất lượng tốt hơn và dài hơn so với chồi trên môi trường rắn Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra nuôi ở môi trường tự nhiên bình thường như trên môi trường thạch IV Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong sản suất sinh khối tế bào thực vật và các hợp chất có giá trị cao 1 Nhân sinh khối callus:... có một số thành công trong việc sử dụng Bioreactor nuôi cấy huyền phù tế bào như cây thông đỏ, cây dừa cạn, cây sam Triều Tiên, cây lan gấm với thể tích của bình nuôi cấy từ vài chục lít đến vài chục nghìn lít Saurbh C và cộng sự (2001), khi nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor 3L, thì sinh khối và hợp chất podophyllotoxin thu được từ nuôi cấy huyền phù cây Polophyllum hexandrum là 6,5g/l và 4,26mg/l... dụng để trị co thắt và gây mê Nuôi cấy huyền phù tế bào cà độc dược (Datura metel) có bổ sung tropic acid (như một tiền chất) thì có thể tăng hàm lượng alkaloid lên 15 lần - Saponin và sapogenin: Là một dược phẩm quý giá, có nhiều trong rễ cây nhân sâm (Panax ginseng) Tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy nhược cơ thể, tăng cường sinh lực Nuôi cấy huyền phù tế bào cây P ginseng đang tiến hành . của nuôi cấy huyền phù tế bào trong nhân giống vô tính - Quy trình nuôi cấy: Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thường qua hai bước cơ bản là nuôi cấy callus và nuôi cấy dịch huyền phù: - Nuôi. dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. 2. Đặc trưng cuả tế bào nuôi cấy huyền phù: - Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một. cho nuôi cấy huyền phù tế bào. - Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào