1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư tế bào gan nguyên phát hay ung thư biểu mô tế bào gan (UBTG: Hepatocellular carcinoma) loại ung thư thường gặp Thống kê hàng năm toàn giới có khoảng 600.000-650.000 ca tử vong, đứng hàng thứ ba loại tử vong liên quan đến ung thư Các phương pháp chẩn đoán UBTG bao gồm khám lâm sàng, xét nghiệm phát dấu ấn ung thư, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, sinh thiết gan chẩn đốn tế bào mơ bệnh học Bằng phương pháp UBTG thường phát giai đoạn muộn bệnh Lúc này, phương pháp điều trị mang lại hiệu quả, thời gian sống sau chẩn đoán UBTG thường vòng tháng đến năm Đối với loại ung thư khác người ta xác định tổn thương tiền ung thư dị sản chỗ, UBTG điều gặp nhiều khó khăn UBTG thường xác định khối u rõ ràng khơng có khả chữa trị Ngay việc phát khối u có kích thước 10-20 mm nhỏ thách thức cho thầy thuốc lâm sàng cận lâm sàng Vì vậy, việc phát dấu ấn sinh học để chẩn đoán sớm UBTG yêu cầu cần thiết HBx gene có kích thước nhỏ gene virus viêm gan B (HBV), mã hoá cho protein có kích thước 17 kDa (Kilodalton), có vai trị trung tâm trình nhiễm virus bệnh sinh UBTG Đây protein đa chức năng, hoạt động yếu tố phiên mã tiềm tàng, có khả hoạt hoá cho nhiều gene tế bào, đặc biệt hoạt hóa số dịng dẫn truyền tín hiệu nội bào Hậu tác động gây rối loạn trình tăng sinh biệt hóa tế bào, chết tế bào theo chương trình cuối tiến triển thành UBTG Thực tế nghiên cứu gần chứng minh đột biến gene HBx HBV có liên quan đến bệnh sinh UBTG Do tính chất quan trọng gene HBx nên có đột biến gây nên nhiều biến đổi liên quan đến mức độ bệnh nhiễm HBV Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, độ biệt hóa tế bào u đột biến gene HBx bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm virus viêm gan B” với mục tiêu: Khảo sát đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, độ biệt hóa tế bào u bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm virus viêm gan B Xác định tỷ lệ mối liên quan đột biến gene HBx virus viêm gan B với số số cận lâm sàng bệnh nhân viêm gan mạn ung thư biểu mô tế bào gan NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN * Ý nghĩa đề tài: Gene HBx gen có kích thước nhỏ virus viêm gan B (HBV), gene có vai trị quan trọng sinh bệnh học nhiễm HBV ung thư gan (UBTG) Đột biến gene HBx nghiên cứu nhiều giới, nhiên chưa nghiên cứu Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV nước ta thuộc nhóm cao giới Để xác định vai trò đột biến gene HBx chẩn đốn tiên lượng UBTG chúng tơi tiến hành giải trình tự gene 148 bệnh nhân, có 54 bệnh nhân viêm gan B mạn tính (VGM) 94 bệnh nhân UBTG Kết cho thấy: (i) Có điểm đột biến thường gặp xác định gene HBx HBV với tỷ lệ tương ứng: C1653T (44,6%); T1753C (17,6%); A1762T (70,3%); G1764A (70,9%) C1766T (15,5%); (ii) Tất đột biến tìm thấy nhiều nhóm UBTG so với nhóm VGM: C1653T (66% so với 7,4%); T1753C (24,5% so với 5,6%); A1762T (83% so với 48,1%); G1764A (81% so với 53,7%) C1766T (21,3% so với 5,6%); (iii) Tất vị trí đột biến tìm thấy gene HBx HBV có nguy gây UBTG (OR, CI, 95%): C1653T: 24,2 (7,7-98,2); T1753C: 4,8 (1,3-26,2); A1762T: 5,3 (2,3-12,1); G1764A: 3,6 (1,6-8,2); C1766T: 4,6 (1,3-25,2); (iv) Đột biến kép A1762T/G1764A có liên quan đến mức độ biệt hóa tế bào gan; (v) Nồng độ HBV DNA bệnh nhân đột biến gene HBx vị trí 1653, 1762 1764 nhóm tế bào có độ biệt hóa vừa thấp có ý nghĩa so với nhóm có gene HBx bình thường * Cấu trúc luận án Luận án có 123 trang, gồm phần: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (36trang), đối tượng phương pháp nghiên cứu (17 trang), kết nghiên cứu (27 trang), bàn luận (37 trang), kết luận (2 trang) Ngồi ra, luận án cịn có phần: cơng trình nghiên cứu, 160 tài liệu tham khảo, 31 bảng, 20 biểu đồ, 13 hình phụ lục Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình dịch tễ bệnh UBTG 1.1.1 Trên giới UBTG loại ung thư phổ biến giới, chiếm khoảng 5,6% tất loại ung thư, đứng hàng thứ năm bệnh ung thư nguyên nhân gây tử vong cao đứng hàng thứ ba sau ung thư phổi dày nam giới Ước tính hàng năm có 500.000-1.000.000 người mắc bệnh mới, 600.000 ca tử vong 1.1.2 Tại Việt Nam Hiện nay, Việt Nam chưa có thống kê đầy đủ toàn quốc, chủ yếu dựa số liệu thu thập từ sở khám chữa bệnh cho thấy UBTG ung thư phổ biến, tần suất gặp cao 1.2 Nguyên nhân yếu tố nguy gây UBTG Yếu tố nguy chủ yếu liên quan đến tiến triển thành UBTG xơ gan Tuy nhiên, Mỹ có ¼ trường hợp UBTG khơng tìm thấy yếu tố nguy Các yếu tố nguy tiến triển thành UBTG biết khác Virus viêm gan B (HBV) C (HCV), chất độc rượu Aflatoxin, rối loạn chuyển hóa đái tháo đường gan nhiễm mỡ, bệnh thừa sắt sắc tố di truyền bệnh liên quan đến yếu tố miễn dịch xơ gan mật nguyên phát viêm gan tự miễn 1.3 Các phương pháp chẩn đoán UBTG Hiện nay, việc chẩn đoán UBTG tiến hành dựa phương pháp như: khám xét lâm sàng, xét nghiệm dấu ấn ung thư (AFP), chẩn đốn hình ảnh chẩn đoán giải phẫu bệnh 1.3.1 Khám xét lâm sàng Những biểu triệu chứng UBTG giai đoạn sớm thường nghèo nàn, phần lớn trường hợp đến khám chẩn đoán chuyển sang giai đoạn muộn, khối u gan lớn đồng thời với việc xuất triệu chứng thực thể rõ ràng 1.3.2 Xét nghiệm dấu ấn ung thư (Alpha-fetoprotein, AFP) Trong số xét nghiệm huyết học, AFP cho có giá trị chẩn đốn UBTG cao Ở Việt nam, theo Vũ Văn Khiên với mức AFP 500 ng/ml giá trị ngưỡng chẩn đốn UBTG, độ nhậy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dự báo dương tính tỷ lệ âm tính giả AFP tương ứng 50%; 100%; 100% 50% 1.3.3 Các phương pháp chẩn đốn hình ảnh Theo hướng dẫn EASL (The European Association for the study of the liver), chẩn đoán UBTG mà không cần sinh thiết gan, khối u gan có kích thước >2cm, với hình ảnh tăng sinh mạch phương pháp chẩn đốn hình ảnh kết hợp mức AFP >200 ng/ml với hai phương chẩn đốn hình ảnh ung thư điển hình bổ xung kết hợp với mức AFP >200 ng/ml Tuy nhiên, theo AASLD (American Association for the Study of Liver Diseases), cung cấp thêm độ xác cho chẩn đốn tổn thương u có kích thước từ đến cm, mà độ nhạy AFP thường rõ rệt Nếu hai phương pháp chẩn đốn hình ảnh chụp cắt lớp vi tính cộng hưởng từ cho thấy có hình ảnh tăng sinh mạch giai đoạn động mạch, tổn thương u coi UBTG 1.3.4 Phương pháp chẩn đoán giải phẫu bệnh Muốn biết chất khối u gan, tốt sinh thiết chọc hút tế bào để làm xét nghiệm mô bệnh học và/hoặc tế bào học Giá trị việc dùng kim để sinh thiết hay chọc hút tế bào gan có độ nhậy độ đặc hiệu cao, đạt 95%-98% 1.4 Một số hiểu biết HBV 1.4.1 Tình hình nhiễm HBV giới Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B Virus: HBV) nguyên nhân hàng đầu gây bệnh lý gan Ước tính giới có tỷ người nhiễm HBV, 350 - 400 triệu người mang HBV mạn tính 1.4.2 Tình hình nhiễm HBV Việt nam Việt Nam quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao giới, khoảng từ 20-26% quần thể người khoẻ mạnh có HBsAg dương tính 1.4.3 Cấu trúc, gene HBV 1.4.3.1 Đặc điểm hình thái HBV loại virus nhỏ thuộc họ HepDNAavirus, loại virus hướng gan có nucleic acid nhân lõi xoắn kép DNA đóng vịng khơng kín, có vỏ bọc q trình nhân lên khơng làm tan tế bào 1.4.3.2 Cơ chế bệnh sinh HBV Quá trình nhân lên HBV khơng gây độc trực tiếp cho tế bào gan Cơ chế đáp ứng miễn dịch vai trị chế bệnh sinh nhiều điểm chưa thống 1.4.4 Vai trò HBV sinh bệnh học UBTG Cơ chế gây ung thư bệnh nhân nhiễm HBV nghiên cứu tích cực Kết cho thấy yếu tố chủ yếu viêm hoại tử tế bào gan, sau tăng sinh tế bào gan, xơ hóa xơ gan, cuối UBTG Tuy nhiên, UBTG xảy bệnh nhân mang HBV mà khơng có xơ gan Do đó, yếu tố thân HBV tế bào gan thể chủ đóng vai trị gây nên bệnh cảnh cuối Vì vậy, bên cạnh việc xem xét yếu tố thân thể chủ, cần phải tìm hiểu yếu tố virus có liên quan đến ung thư gan nhiễm HBV - Vai trò protein HBV sinh bệnh học UBTG - Kiểu gene HBV sinh bệnh học UBTG - Vai trò đột biến gene HBV nồng độ HBV DNA UBTG - Vai trò yếu tố virus tiến triển UBTG khơng có xơ gan 1.4.5 Vai trị HBx sinh bệnh học UBTG Protein HBx có kích thước 154 acid amin, khối lượng phân tử 17 kDa protein nhỏ protein HBV Người ta thấy gene HBx ổn định tất lồi HBV động vật có vú Vùng ổn định gene nằm “vùng xoắn ốc: helical” thuộc phần cuối đầu 3’ gene HBx (hoặc phần cuối C protein HBx) Nghiên cứu cho thấy protein HBx thường biểu bệnh nhân viêm gan B cấp mạn tính, lại biểu nhiều bệnh nhân UBTG Vì xuất protein HBx huyết xem dấu ấn có giá trị dự báo UBTG bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính 1.4.6 Các đột biến gene HBx thường gặp liên quan UBTG HBV có tỷ lệ đột biến cao mà khơng có giới hạn khung đọc mở, nhiều kết nghiên cứu phân tích mối tương quan đa chiều cho thấy đột biến vùng khởi động nhân (Basal core promoter: BCP) thường gặp có liên quan đến bệnh sinh ung thư gan 1.5 Tình hình nghiên cứu HBx Việt nam Vai trò HBx sinh bệnh học UBTG nghiên cứu tích cực giới thu số kết đáng quan tâm Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu đột biến gene HBx Các nghiên cứu chủ yếu tiến hành mẫu bệnh người Việt Nam thực Labo nước Theo ghi nhận chúng tơi chưa có nghiên cứu khảo sát tỷ lệ đột biến gene HBx tìm hiểu mối liên quan với bệnh sinh UBTG tiến hành Việt Nam Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Tổng số có 94 bệnh nhân UBTG 54 bệnh nhân VGM (viêm gan B mạn) có HBsAg (+) 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn + UBTG có HBsAg (+), theo tiêu chuẩn Hội Tiêu hóa giới + VGM, chọn theo tiêu chuẩn Hội gan mật Mỹ 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ + Bệnh nhân có anti HIV (+), anti HCV (+) + Những người không đồng ý làm thủ thuật 2.2 Phương pháp nghiên cứu: Tiến cứu, mô tả cắt ngang 2.2.1 Phương pháp chọn mẫu Tất bệnh nhân UBTG nhiễm HBV xác định chẩn đoán tế bào bệnh học lựa chọn để đưa vào nhóm nghiên cứu Đối với nhóm chứng, chúng tơi lựa chọn tất bệnh nhân viêm gan B mạn tính xác định chẩn đốn mơ bệnh học 2.2.2 Thiết kê nghiên cứu Sau lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu VGM UBTG nhiễm HBV tiến hành xét nghiệm nghiên cứu nồng độ HBV DNA, xét nghiệm đột biến gene HBx Từ kết tiến hành phân tích tìm hiểu mối liên quan số HBV DNA, điểm đột biến gene HBx với số tuổi, giới, đặc điểm khối u, xét nghiệm sinh hóa AST, ALT, Bilirubin, Protein toàn phần, Albumin, kết Tế bào bệnh học 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu lâm sàng xét nghiệm + Mỗi bệnh nhân đăng ký vào phiếu theo dõi xây dựng có đầy đủ tiêu dịch tễ, lâm sàng xét nghiệm + Các số liệu thu thập đầy đủ, đăng ký theo mẫu thống nhất 10 + Xét nghiệm (Huyết học, Sinh hóa, Miễn dịch, Sinh học phân tử,…) tiến hành Bệnh viện TƯQĐ 108 2.3 Nội dung nghiên cứu: Theo mục tiêu nghiên cứu 2.4 Các xét nghiệm - Các phương pháp miễn dịch, sinh hoá, hoá nghiệm, chẩn đoán hình ảnh, mơ bệnh học, tế bào học - Định lượng nồng độ HBV DNA: kỹ thuật Real time – PCR theo phương pháp Taqman - Kỹ thuật xác định đột biến gen HBx: phương pháp giải trình tự gen máy CEQ 8800, Beckman Couldter, Mỹ 2.5 Thu thập xử lý số liệu Các số liệu phân tích phần mềm Statview, version 4.5, chương trình STATA 7.0 SPSS 15 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân (BN) nghiên cứu Bảng 3.1 Đặc điểm giới tuổi nhóm BN nghiên cứu Các số Giới (Nam/nữ) Tuổi UBTG (n=94) 80/14 55,1±13,2 VGM (n=54) 48/6 42,5±12,3 Nhận xét: Tỷ lệ nam/nữ khơng có khác biệt, tuổi bệnh nhân UTBG cao VGM Bảng 3.2 Nồng độ HBV DNA nhóm nghiên cứu Chỉ số Nhóm NC UBTG HBV DNA (copies/ml) Trung bình ± Độ lệch chuẩn 3,1 x 108 1,05 x 108 p