Các phương pháp phát hiện virus gây bệnh cho lan [10/12/2008 - Sinh học Việt Nam] Đối với các nhà vườn lan thì việc khó khăn nh ất và nguy hại nhất là s ự gây hại nghiêm trọng của các tác nhân gây bệnh cho cây lan, gồm có côn trùng, nấm, vi khuẩn, virus. Trong đó, mức đ tác h ại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất vì không phát hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức độ lây lan cao. Trong đó hai lo ại virus chính gây hại nghiêm trọng cho lan là virus CymMV (Cymbidium mosaic virus) và ORSV ( Odontoglossum ringspot virus). Do vậy, việc phát hiện sớm để ngăn ng ừa và kiểm soát virus gây nhiễm là vấn đề then chốt đ ặt ra cho các nhà nông cũng như là các nhà nghiên cứu nuôi trồng lan. Mà đ ặc biệt là làm sao có thể dể dàng phát hiện và chẩn đoán s ớm 2 loại virus này bằng các kỹ thuật thật đơn giản, ít tốn kém và đầu t ư là đi bận tâm rất lớn của các nhà nông. Cũng đã có rất nhiều nghiên cứu tìm phương pháp tối ưu nhất đ ể phát hiện 2 loại virus này, bao gồm các phương pháp miễn dịch như ELISA, RIPA (rapid immunofilter paper assay) [3]; phươn pháp PCR; các test nhanh; phương pháp sắc ký; … Hiện nay, cũng có nhiều sản phẩm đang lưu hành trên thị trường dung để phát hiện 2 loại virus này như kit DAS-ELISA c ủa hãng DSMZ (D 0187, D-0493, D-0100) [8], các test thử nhanh của Agdia [6], các kit Monoplex, Multiplex RT- PCR,… I. PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HẠI LAN BẰNG CÁC TEST THỬ NHANH Các loại test thử nhanh này dùng đ ể sàng lọc và phát hiện sớm các mẫu nghi ngờ bị nhiễm bệnh nhằm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh hiệu quả. Cách sử dụng các loại test thử này rất đơn gi nhanh chóng và không cần đầu tư trang thiết bị hiện đại hay kiến thức chuyên sâu nh ư phương pháp chẩn đoán khác ELISA, PCR; chúng rất tiện lợi khi mang theo và thực hiện ở bất cứ n ơi nào trong nhà kính hay vườn nuôi mà không cần gửi mẫu đến phòng thí nghi ệm; vì vậy chúng rất phù hợp và tiện lợi cho nông dân nuôi trồng lan. Và giá thành so với ph ương pháp ELISA hay PCR c ít hơn rất nhiều. V ề nguyên tắc của các test này là dựa vào phản ứng tạo màu khi có sự hiện diện của 1 kháng nguyên (protein màng bao c ủa virus) kết hợp chuyên biệt với kháng thể tạo phức hợp có màu nhìn thấy được bằng mắt thường. Hiện nay, trên thị trư ờng thế giới có rất nhiều dạng test kit này của các công ty nổi tiếng, có uy tín; ở đây tôi xin giới thiệu 1 số sản phẩm để tham khảo: 1. Kit Agdia Orchid ImmunoStrip ® [6] Kit thử nhanh Agdia Orchid ImmunoStrip ® của hãng Agdia (www.agdia.com) là 1 trong nh ững kít phát hiện nhanh dược sử dụng phổ biến nhất để phát hiện đ ồng thời 2 loại virus gây bệnh cho thực vật, virus chính gây tác hại nghiêm trọng cho công tác nuôi trồng lan là Cymbidium mosaic virus (CymMV) và Odontoglossum ringspot virus (ORSV). Kit này rất tiện lợi cho việc phát hiện đ ồng thời cả hai lọai virus trên chỉ trong vòng ít phút. Kết quả được thể hiện rất rõ ràng và cách s ử dụng giản, tiện lợi khi dùng bất cứ ở đâu trong vư ờn hay nhà kính. Chỉ cần cho mẫu nghi ngờ vào túi chuyên dụng đã chứa sẳn dung dịch đệm SEB1 của kít và đ ặt các que thử (strip) vào trong túi. Kết quả dương tính thể hiện mẫu nhiễm virus khi có sự xuất hiện vạch màu trong vòng 20- 30 phút khi so sánh với mẫu đ ối chứng: kết quả xuất hiện 3 vạch màu là nhiễm cả 2 loại virus; test chỉ xuất hiện 2 v ạch chỉ nhiễm 1 loại virus (CymMV hoặc ORSV) và âm tính khi chỉ xuất hiện 1 vạch màu (chi tiết ở hình 1): Hình 1: hình minh họa kết quả phát hiện virus CymMV và ORSV bằng kit Agdia (www.agdia.com). 2. Pocket Diagnostics Orchid virus screen - Cymbidium mosaic vi rus and Odontoglossum ringspot virus [7,9] S ản phẩm gồm có 1 pack silica chứa 1 test phát hiện CymMV, 1 test phát hiện ORSV, 1 ống chứa dung dịch tách chiết (extraction bottle), 1 pipett nhựa, vài vòng bi thép sạch,. Hình 2: các sản phẩm của kit Pocket Diagnostics Orchid virus screen (http://jwund.homestead.com/pdviruskit.html) Cách thực hiện kit này rất dễ dàng tiện dụng, không cần kinh nghiệm và dể bảo quả n (lưu tr nhiệt độ phòng, khô thoáng): -Sử dụng mẫu lá mới nhất nghi ngờ nhiễm bệnh. -Cắt các mẫu mô lá này thành những mảnh nhó có kích thước khoảng 5-7mm theo chi ều rộng, và chiều dài khoảng 1-2cm, sau đó lát mỏng các mẫu lá này theo chiều dọc. Đối vớ i m hoa, chỉ cần cắt nhó. -Thực hiện 3 vạch cắt chéo ngang mẫu lá đã lát mỏng, và đặt vào trong extraction bottle. -L ắc trong vòng 30 giây. Lấy vài giọt mẫu sau khi lắc nhỏ vào giếng tròn của dụng cụ test phát hiện virus. -Trong vòng 3-5 phút kết quả xuất hiện sẽ cho biết mẫu dương tính hay âm tính: kết quả d ương tính có 2 vạch màu xuất hiện ở dòng ghi chữ C (đ ối chứng) và T (virus ORSV hoặc CymMV ), kết quả âm khi chỉ có 1 vạch ở dòng ghi chữ C. Hình 3: kết quả phát hiện virus với kit Pocket Diagnostics Orchid virus screen (http://jwund.homestead.com/pdviruskit.html) II. PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HẠI CHO LAN BẰNG RT-PCR Phát hiện virus gây hại bằng RT-PCR là 1 phương pháp có độ tin cậy cao h ơn các phương pháp khác. Bằng cách phát hiện sự hiện diện của 1 gene nào đó của virus, cụ thể đ ối với virus CymMV và ORSV là gene CP (coat protein gene), gene t ổng hợp protein màng bao của virus. Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này rất tốn kém, đòi h ỏi phải có phòng thí nghiệm tân tiến có trang thiết bị hiện đại đầy đủ như máy PCR, bộ đi ện di, máy chụp gel, các thiết bị chuyên dùng khác và hóa chất rất đắt tiền. Và đòi hỏi người thực hiện phải có trình độ chuyên môn cao. Qui trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản như sau [1]: Tách chiết RNA: RNA tổng số được tách chiết từ mô lá của mẫu Lan nghi ngờ và 1 mẫu thực vật làm đ ối chứng theo hướng dẫn kit tách chiết (ở đây tôi trình bày tóm t ắt cách sử dụng của kit Plant Total R Extraction Miniprep system; Vio gene, Mỹ): -100mg mô lá lan được nghiền ra trong nitơ lỏng.Chuyển vào eppendorf. -Bổ sung 450 µl RX buffer. Trộn đều. -Lọc dung dịch qua cột (Shearing tube column). -Rửa cột với 230 µl ethanol tuyệt đối. Lọc dung dịch qua c ột (Plant total RNA tube column) của kit. -Rửa cột lần nữa 1 lần với dung dịch WF, và 2 lần với dung dịch WS. -Hòa RNA tổng số trong 50 µl nước cất 2 lần. -Đo nồng độ RNA thu được. -Lưu trữ -80 o C đến khi dùng. Trình tự primer: Cặp primer tổng hợp gene CP của virus CymMV; sản phẩm có kích thước 669bp: CymMV CP-F1: ATGGGAGAGYCCACTCCARCYCCAGC CymMV CP-R1 TTCAGTAGGGGGTGCAGGCA. Cặp primer tổng hợp gene CP của virus ORSV; sản phẩm có kích thước 474bp: ORSV CP-F1 ATGTCTTACACTATTACAGACCCG. ORSV CP-R1 GGAAGAGGTCCAAGTAAGTCC. Cặp primer tổng hợp gene nad5 mRNA c ủa thực vật dùng làm chứng nội; sản phẩm có kích thước 185 bp: mt-F2 GCTTCTTGGGGCTTCTTGTTCGATA mt-R1 ATCTCCAGTCACCAACATTGGCAT a. Thực hiện phản ứng Monoplex RT-PCR: Chuẩn bị phản ứng RT: Đối với Mẫu phân tích: (Chuẩn bị mẫu đối chứng tương t ự ngoại trừ không có sản phẩm RNA của virus sau tách chiết): - Trộn từng loại 2 µl RNA tổng số (virus và thực vật) (nồng độ khoảng 200ng) đã tách chi ết ở trên tương ứng với từng loại 0.5 µl primer ngược (nồng độ 5µM): RNA của virus CymMV: sử dụng primer CymMV CP-R1. RNA của virus ORSV: sử dụng primer ORSV CP-R1. RNA của thực vật: sử dụng primer mt-R1. Tiếp tục trộn hổn hợp trên với 5 µl nước cất 2 lần. Đun 10 phút ở 70 o C, làm lạnh ngay trên đá trong 5 phút. Tiếp tục bổ sung vào hổn hợp RT gồm: Nước cất 2 lần3.25 µl Buffer (5x, Promega) 2.5 µl dNTPs (10mM) 1.25 µl RNasin (40 U/µl, Promega) 0.25 µl AMV reverse transcriptase (10 U/l, Promega) 0.25 µl ủ phản ứng trên ở 42 o C trong 60 phút. Tiếp tục bổ sung các hóa chất sau đ ể tiến hành phản ứng PCR: (sử dụng mỗi cặp primer cho từng mẫu RNA tương ứng): Sản phẩm của phản ứng RT 2 µl DyNAzyme ™ II DNA polymerase buffer (10x, Finnzymes Inc.) 2 µl 1 cặp Primer xuôi và ngược (5µM)2 µl dNTPs (2 mM) 2 µl DyNAzyme ™ II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl, Finnzymes Inc.) 0.4 µl Nước cất 2 lần 11.6 µl. Sau khi đã chuẩn bị, tiếp theo là đặt các phản ứng vào máy PCR và thiết lập chương tr ình ph ứng như sau: Bước 1: biến tính ở 96 o C trong 5 phút. Bước 2: 96 o C trong 30 giây. Bước 3: 52 o C trong 30 giây. Bước 4: 72 o C trong 30 giây. Lặp lại 30 chu kỳ từ Bước 2 đến Bước 4. Bước 5: 72 o C trong 7 phút. Và cuối cùng là phân tích sản phẩm khuếch đ ại trên gel agarose, nhuộm gel và quan sát trên máy đọc UV để xác định kích thước các vạch DNA xu ất hiện trên gel khi so sánh với thang chuẩn DNA ladder 1kb Plus (Invitrogen). Từ đó suy ra kết quả. b. Thực hiện phản ứng Multiplex RT-PCR: Chuẩn bị và thực hiện tương tự như Monoplex RT-PCR. Tuy nhiên, có vài điều khác biệt cần l ưu Phản ứng RT: Được chuẩn bị và thực hiện tương tự như phản ứng Monoplex RT-PCR, ngoại trừ 3 primer ng ư (primer reverse CymMV CP-R1, ORSV CP-R1 và mt-R1) là được cho vào đ ồng thời trong cùng 1 phản ứng. Và nồng độ RNA của virus có thể pha loãng bậc 10 thành nhiều nồng đ ộ (10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg và 1 fg) để xác định ngư ỡng phát hiện của phản ứng Multiplex RT-PCR sau này. Phản ứng PCR: sử dụng đồng thời 3 cặp primer cho tứng mẫu RNA: Sản phẩm của phản ứng RT 2 µl DyNAzyme ™ II DNA polymerase buffer (10x, Finnzymes Inc.) 2 µl 3 cặp Primer (5µM) 2 µl dNTPs (2 mM) 2 µl DyNAzyme ™ II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl, Finnzymes Inc.) 0.4 µl Nước cất 2 lần 11.6 µl. Về cơ bản thì qu trình phát hiện virus gây bệnh lan gồm những bước như trên, tuy nhiên có th ể thay đổi 1 số thành phần hóa chất từ thực vật hay điều kiện phản ứng để cải tiến tốt h ơn như thay đ thành ph ần Taq DNA polymerase của hãng Biorad, Roche, Qiagen, , kit tách chiết RNA của Qiagen… Vũ Thủy Tiên tổng hợp từ nguồn: 1.Shu-Chuan Lee1 and Ya-Chun Chang. Multiplex RT- PCR detection of two orchid viruses with an internal control of plant nad5mRNA. Plant Pathology Bulletin 15:187-196, 2006. 2.M. Navalinskienë, J. Raugalas, M. Samuitienë. Viral diseases of flower plants. Identif ication of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.). BIOLOGIJA. 2005. Nr. 2. P. 29–34. 3.S. Tanaka, H. Nishii, S. Ito, and M. Kameya-Iwaki, and P. Sommartya. Detection of Cymbidium Mosaic Potexvirus and Odontoglossum Ringspot Tobamovirus from Thai Orchi ds by Rapid Immunofilter Paper Assay.Plant Disease / Vol. 81 No. 2, p.167-170. 1997. 4.J. S. Hu, S. Ferreira, M. Wang and M. Q. Xu. Detection of Cymbidium Mosaic Potexvirus, Odontoglossum Ringspot virus, Tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecti ng orchids in Hawaii. Plant Disease / Vol. 77 No. 5, p.464-468. 1993. 5.K. Yamane, K. Oyama, E. Iuchi, H. Ogawa, T. Suzuki and T. Natsuaki. RT- PCR Detection of Odontoglossum ringspot virus, Cymbidium mosaic virus and Tospoviruses and Association of Infections with Leaf-Yellowing Symptoms in Phalaenopsis. Journal of Phytopathology. Volume 156 Issue 5, Pages 268 – 273; 2008. . kết quả phát hiện virus với kit Pocket Diagnostics Orchid virus screen (http://jwund.homestead.com/pdviruskit.html) II. PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HẠI CHO LAN BẰNG RT-PCR Phát hiện virus gây hại. Các phương pháp phát hiện virus gây bệnh cho lan [10/12/2008 - Sinh học Việt Nam] Đối với các nhà vườn lan thì việc khó khăn nh ất và nguy hại nhất là s ự gây hại nghiêm trọng của các. phát hiện nhanh dược sử dụng phổ biến nhất để phát hiện đ ồng thời 2 loại virus gây bệnh cho thực vật, virus chính gây tác hại nghiêm trọng cho công tác nuôi trồng lan là Cymbidium mosaic virus