1 Kỹ thuật chuyển gen cho động vật I. KháI NIệM Về chuyển gen Cho động vật 1.1. Định nghĩa Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều gen lạ đ đợc thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen đợc xem là thành công khi gen chuyển vào đợc tổ hợp vào genom của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp đợc duy trì ổn đinh qua các thế hệ con cháu 2 1.2.Lợc sử phát triển 1977 Gurdon chuyển ARNm và ADN vào phôi Xenopus (ếch) và quan sát thấy sự biểu hiện chức năng của chúng 1980 Brinster và cs nhận đợc kết quả tơng tự ở chuột 1981 Wagner và cs đã cấy chuyển thành công gen -globulin của thỏ vào phôi chuột Từ 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo thỏ, cừu, lợn, bò chuyển gen và các vật nuôi chuyển gen tăng trởng nhanh đợc ứ ng dụng m ạ nh m ẽ trong n ô ng nghi ệ p 1.3. mục đích chuyển gen Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi cấy để sản xuất protein in tái tổ hợp Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các sản phẩm sữa, thịt, lông Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp Tạo vật nuôi chuyển gen knock out làm mô hình nghiên cứu về y sinh học các bệnh di truyền Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền (của ngời) 3 1.4. Đối tợng chuyển gen Hầu hết các phơng pháp chuyển gen đợc phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng đợc ứng dụng trên gia súc, gia cầm Việc chuyển gen thờng đợc thao tác trên: - Tế bào trứng đ thụ tinh - Tế bào tinh trùng - Mô phôi ở giai đoạn sớm - Tế bào gốc phôi II.Các phơng pháp chuyển gen vào tế bào động vật Phơng pháp chuyển gen trực tiếp : -Chuyển gen nhờ phốt phát canxi -Chuyển gen nhờ xung điện -Chuyển gen nhờ vi tiêm -Chuyển gen nhờ liposom Phơng pháp chuyển gen gián tiếp : Chuyển gen nhờ virus 4 II.1.Các phơng pháp Chuyển gen trực tiếp 1.Chuyển gen nhờ phosphat canxi Kỹ thuật phosphat canxi để đa gen vào tế bào động vật có vú lần đầu đợc Graham và Vander Eb đề xuất năm 1973 và cho đến nay vẫn đợc áp dụng rộng rãi. Kỹ thuật này có thể sử dụng để đa DNA vào tế bào động vật có vú với mục đích các test thể hiện chuyển nạp hay biến nạp lâu dài. 1.Chuyển gen nhờ phosphat canxi Nguyên tắc: Các DNA ngoại lai đợc trộn với CaCl2 sau đó đợc chuyển vào một dung dịch chứa ion phosphat. Một phức hợp đồng ngng kết (coprecipitate) giữa canxi phosphat và DNA sẽ đợc hình thành. Phức hợp này sẽ đợc các tế bào động vật có vú tiếp nhận khi nuôi cấy thông qua thực bào , kết quả là có thể tạo tế bào chuyển gen với sự thể hiện gen ngoại lai trong tế bào. Các DNA chuyển nạp mang một gen chỉ thị chọn lọc (nh gen aminoglycoside phosphotransferase) để giúp cho việc thanh lọc các tế bào không tiếp nhận DNA. 5 6 2.Chuyển gen nhờ xung điện Nguyên tắc: Khi trong điện trờng có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung điện (điện thế cao trong một thời gian rất ngắn), lúc đó trên màng tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ. Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có thể tơng tác với genome của tế bào tạo tế bào chuyển gen. 2.Chuyển gen nhờ xung điện (tiếp) Máy tạo xung điện thờng đợc thiết lập một công suất ổn định và cả thời gian gây xung ổn định với các điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm. Đối với hầu hết tế bào, sự thiết lập nh vậy đảm bảo 20-50% số tế bào còn sống sau khi thực nghiệm chuyển DNA. Quá trình chuyển gen nhờ xung điện đợc thực hiện ở nhiệt độ phòng còn các tế bào đợc giữ liên tục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ các tế bào. 7 8 M¸y t¹o xung ®iÖn 9 2.Chuy ể n gen nhờ xung điện (tiếp) Chú ý Các DNA đã đợc duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gen cao hơn các DNA ở dạng siêu xoắn, do ở dạng thẳng chúng dễ tơng tác hơn vào bộ genome của tế bào đích. Để chuyển gen bằng kĩ thuật này cần sử dụng huyền phù tế bào đơn, tránh sử dụng các tế bào dính lại với nhau vì các khối tế bào này hay dính vào thành bình làm giảm hiệu quả chuyển nạp. Nói chung, để chuyển gen bằng phơng pháp này cần sử dụng nhiều DNA cũng nh tế bào hơn so với phơng pháp hoá học. Mỗi loại tế bào có các thông số kỹ thuật tối u khác nhau khi sử dụng kĩ thuật này. 3.Chuyển gen nhờ vi tiêm Nguyên tắc: Tiêm trực tiếp ADN ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm rất mảnh. Phơng pháp này cho kết quả rất cao nhng số lợng tế bào đợc xử lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào. Phơng pháp này thờng dùng để đa ADN vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm. Việc chuyển gen vào tế bào động vật tốt nhất là chuyển vào một trong những nhân con của trứng đ thụ tinh trớc khi các nhân con kết hợp với nhau để tạo ra hợp tử lỡng bội. Bằng cách chuyển gen vào giai đoạn tiền nhân, gen chuyển vào sẽ đợc truyền cho các thế hệ phôi tiếp theo và có thể di truyền cho con cháu. 10 3.chuyển gen bằng vi tiêm (tiếp) Các bớc tiến hành: Thiết kế cấu trúc gen chuyển Gây siêu bài non ở con cái, thu nhận hợp tử sau khi giao phối Chuẩn bị dung dịch ADN cho vi tiêm Chuẩn bị tế bào hợp tử Vi tiêm ADN vào tiền nhân Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận Kiểm tra gen chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền [...]... biệt để chuyển lactose th nh galactose v glucose 28 2.4 .Chuyển gen v o động vật để sản xuất protein giá trị cao Bằng cách chuyển gen v o động vật lấy sữa có thể thu đợc sữa có mang các protein l sản phẩm c a gen chuyển nạp: Chuyển gen tạo Lysostaphin: kháng khuẩn gây bệnh viêm vú Chuyển gen sản xuất Factor VIII (ngời): yếu tố đông máu 1 antitrypsin (ngời): chất ức chế proteinase -chuyển gen 1antitrypsin... động vật chuyển gen 2.1 .Chuyển gen làm tăng sức sinh trởng Chuy n gen t o hocmon sinh tr ng cho chu t, l n, c u, cỏ h i b ng phng phỏp vi tiờm gen GH vo nhõn con c a tr ng ó th tinh, ó thu c ng v t chuy n gen cú bi u hi n c a gen chuy n n p ((Tỷ lệ th nh công khi chuyển gen: chuột 25%, lợn: 10,4%, cừu: 1,3% v bò 0,6%) Chuột chuyển gen hoocmon sinh trởng (phải) v chuột đối chứng 26 C H I CHUY N GEN. .. hớng nghiên cứu tạo vật nuôi chuyển gen: Tăng trởng: l m tăng tốc độ sinh trởng v chất lợng th nh phần cơ thể động vật thông qua chuyển các gen điều ho hocmon tăng trởng Kháng bệnh: Xác định v chuyển các gen có thể tác động đến tính kháng bệnh ở vật nuôi (gen kháng bệnh chuyên biệt, gen receptor tế b o T, gen mã hoá lymphokine, ) Cải tiến chất lợng, th nh phần sản phẩm: chuyển gen l m giảm h m lợng... 50 for his work toward developing genetically-modified mosquitoes resistant to malaria 3.Tồn tại trong tạo động vật chuyển gen Cải tiến giống động vật bằng kỹ thuật chuyển gen l chiến lợc đúng đắn v đ có những th nh công nhất định Tuy nhiên còn nhiều vấn đề cần giải quyết bởi sự biểu hiện của các gen đợc chuyển trong cơ thể động vật rất phức tạp v sự di truyền các gen sang các thế hệ sau l vấn đề... có thể đa động vật chuyển gen ra quần thể bên ngo i th nh công cần phải đạt đợc những điều kiện tiên quyết sau: Sự chuyển ổn định gen ngoại lai sang thế hệ con, cháu Không xảy ra các đột biến chèn để tạo tạo đợc động vật chuyển gen đồng hợp tử Biểu hiện ổn định của gen chuyển với tác động dơng tính của các tính trạng mục tiêu ít nhất phải tạo đợc 5-10 cá thể chuyển gen đầu dòng ổn định, cho phép đa... gia tăng sự phát triển lông Gene-farming: dùng động vật nh hệ thống cải biến sinh học để sản xuất các protein đặc biệt 25 1 Các hớng nghiên cứu tạo vật nuôi chuyển gen (tiếp) Để kỹ thuật chuyển gen trở th nh công cụ hiệu quả trong tạo giống động vật cần tập trung nghiên cứu các vấn đề cơ bản sau: Cải thiện tối u các phơng pháp chuyển gen Phân lập v định tính đợc các gen mục tiêu Phân lập v đinh tính... nhân các gen mục tiêu có thể có quá trình tái tổ hợp l m cho gen n y đợc gắn v o bộ gen của tế b o chủ tạo tế b o đợc chuyển gen ii.2 chuyển gen gián tiếp nhờ virus Nguyên lý chung Khi xâm nhiễm v o tế b o, virus có khả năng chuyển bộ gen của nó v o tế b o chủ Một số nhóm virus có thể gắn bộ gen hoặc một số gen của chúng v o bộ gen tế b o chủ, tạo th nh một thể thống nhất Các gen virus gắn với bộ gen của... ngoại lai sát nhập v o bộ gen nh thế n o cha đợc hiểu rõ r ng Vấn đề khảm v đột biến chèn l m hiệu quả tạo động vật chuyển gen giảm rõ rệt 35 3.Tồn tại trong tạo động vật chuyển gen Hiên tợng thể khảm: thờng chỉ xảy ra ở thế hệ Fo Nếu cơ quan sinh dục không mang gen chuyển thì các thế hệ con sẽ không đợc thừa hởng gen chuyển Nếu cơ quan sinh dục l mô khảm thì thế hệ con mang gen chuyển có thể nằm trong... Hơn thế, gen chuyển hiếm khi đợc ổn định qua v i thế hệ Đột biến chèn: khi gen chuyển sát nhập v o vị trí lẽ ra l của một gen cần thiết cho sự phát triển của thai thì khi những động vật chuyển gen bán hợp tử (hemizygote transgenic) giao phối với nhau đột biến chèn sẽ đợc thể hiện v không thể sinh ra thế hệ con đồng hợp tử do chúng chết ngay giai đoạn thai 3.Tồn tại trong tạo động vật chuyển gen Để... 10-30 lần) 2.2 Chuyển gen kháng bệnh Chuyển gen kháng bệnh chuyên biệt: Mx l một trong các gen kháng sự nhiễm virus Chuột mang allele trội Mx1+ kháng vi rus cúm A v B, nếu mang allele lăn Mx1không kháng đợc sự xâm nhiễm của virus cúm Chuyển gen Mx1+ cho lợn nhằm kháng virut cúm Orthomyxovirus 27 2.2 Chuyển gen kháng bệnh Biểu hiện gen sản xuất kháng thể đơn dòng trong động vật chuyển gen tạo miễn . 1 Kỹ thuật chuyển gen cho động vật I. KháI NIệM Về chuyển gen Cho động vật 1.1. Định nghĩa Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều gen lạ đ đợc thiết kế ở dạng. vật Phơng pháp chuyển gen trực tiếp : -Chuyển gen nhờ phốt phát canxi -Chuyển gen nhờ xung điện -Chuyển gen nhờ vi tiêm -Chuyển gen nhờ liposom Phơng pháp chuyển gen gián tiếp : Chuyển gen nhờ virus 4 II.1.Các. cừu, lợn, bò chuyển gen và các vật nuôi chuyển gen tăng trởng nhanh đợc ứ ng dụng m ạ nh m ẽ trong n ô ng nghi ệ p 1.3. mục đích chuyển gen Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi cấy