1/ Phương pháp nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm phân biệt : Vì giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (gram-positive) bắt màu tím và vi khuẩn G- (gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dáng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau. 2/ Mô tả sự khác nhau giữa vách tế bào G+ và G- : Vách tế bào G+ : rất dày gồm một lớp peptidoglycan còn được gọi là murein chiếm 80%-90% thành phần vách tế bào. Peptidoglycan là loại polime xốp, không tan, khá cứng và bền vững bao quanh tế bào như một mạng lưới. Cấu trúc cơ bản của peptidoglycan gồm 3 thành phần: N- acetylglucosamine (NAG), acid N-acetylmuramic (NAM) và tetrapeptide gồm cả loại L và D acid amine. Ðể tạo thành mạng lưới cứng, tetrapeptide trên mỗi chuỗi peptidoglycan liên kết chéo với tetrapeptide trên chuỗi khác. Bên trong lớp peptidoglycan là acid teichoic - hợp chất polymer của ribitol-phosphate và glycerol phosphate - một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn G+ vừa liên kết với peptydoglycan vừa liên kết với màng sinh chất. Phần liên kết với peptidoglycan gọi là acid lipoteichoic. Hiện nay đã biết được nhiều kiểu peptidoglycan ở các loài khác nhau gọi là cầu trung gian. Vách tế bào G-: có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần: + Lipid A. + Polysaccharide lõi. + Kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein: + Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ… + Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12,… + Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài. 3/ Mô tả và giải thích sự bắt màu của vi khuẩn G+ và G- qua từng giai đoạn nhuộm màu : Bước 1: nhuộm tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút. G+ và G- đều có màu tím do màu thấm vào lớp peptidoglycan của G+ và màng ngoài của G Bước 2: thêm dung dịch Lugol, để 1 phút. G+ và G- có màu tím đậm hơn do iot tạo phức chất màu với tím tinh thể và cố định màu. Bước 3: Tẩy bằng cồn 96o (15-30 giây). G+ cồn làm cho các lỗ peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể - iot bị giữ lại trong tế bào. G- do cồn làm tan lớp màng ngoài có màu, bản chất là lipid dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot, do đó trong giai đoạn này G- sẽ mất màu. Bước 4: nhộm tiếp Safranin hay Fuchsin Ziehl. G+ vẫn giữ màu tím do không bắt màu Safranin hay Fuchsin Ziehl còn G- bắt màu hồng. Kết luận: với phương pháp nhuộm Gram như trên, G+ giữ lại màu tím, G- giữ lại màu hồng. 4/ Cách cố định tiêu bản : Mục đích là giết chết vi khuẩn và giữ vi khuẩn cố định trên kính không bị trôi trong quá trình nhuộm. Các cách cố định tiêu bản: _ Bằng ngọn lửa: hơ nhanh tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn . _ Bằng cồn: cho cồn 96o vào tiêu bản và để cồn bay hơi hết. _ Ðể tiêu bản khô tự nhiên. 5/ Các yếu tố làm sai lệch kết quả nhuộm : * Sai xót trong thao tác nhuộm Gram, do thực hiện chưa chính xác một vài giai đoạn sau: + Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa không đúng sẽ làm cho màng tế bào bị biến tính dẫn đến sai lệch kết quả nhuộm. + Nhuộm tím tinh thể quá lâu ở G- làm màu thấm vào lớp peptidoglycan bên trong, nên khi tẩy bằng cồn không thể làm sạch màu tím dẫn đến việc G- bắt màu như G+. * Do thời gian nuôi cấy, tuổi của vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn nhiều lần làm mất dần tính chất điển hình của chúng, vì vậy khi nhuộm sẽ không chính xác. * Cấu trúc lớp peptidoglycan của nhiều loài vi khuẩn không phải lúc nào cũng giống nhau hoàn toàn, độ dày có thể sai khác vì vậy khi thực hiện phương pháp nhuộm phải chú ý đến thời gian nhuộm hoá chất cho thích hợp với từng loài. Gram (viết tắt G) là tên của nhà vi khuẩn học người Đan Mạch.Ông này đã dùng thuóc nhuộm đê nhuuộm màu và phân biệt hai nhóm vi khuẩn có cấu tạo khác nhau ( Chủ yếu là khác nhau ở thành ?tế bào ? :?: ) Ở vi khuẩn ?G(+) sau khi nhuộm màu soi trên kính hiển vi chúng bắt màu tím-xanh,còn G(-) bắt màu hồng. Đây là phương pháp nhuộm màu phổ biến đến nay vẫn còn được sử dụng. Để nhớ ơn đến Christian Gram nên người ta đặt tên của phương pháp ?nhuộm màu này là nhuộm Gram. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có cấu trúc: - Peptidoglican là thành phần thứ yếu, ko chứa axit teicoic - Màng ngoài cấu trúc: protein và lớp đôi photpholipit có khảm protein đặc biệt -> bảo vệ vi khuẩn chống sự thấm yếu tố hóa học bên ngoài, ngăn chặn sự xâm nhập của lizozim - Khoảng không gian chứa độc tố, các enzim -> phá hủy kháng sinh trước khi tác động lên màng sinh chất - Cấu trúc nhiều lớp -> bảo vệ _do cấu tao các lớp màng nên tiên mao của gram (+) thì gốc có 2 vòng khuyên còn vi khuẩn gram (-) gốc có 4 vòng khuyên _về axitamin gram(+) có 3-4 loại còn gram (-) có 17-18 loại _tỉ lệ ARN:ADN ở gram (+) là 8:1 còn gram (-) là 1:1 _Gram (+) không có khoang chu chất còn gram (-) có khoang chu chất -Đầu tiên người ta nhỏ thuốc tím tinh thể (Crystal Violet) thì G+ không có lớp vỏ nhầy bảo vệ nên có màu tím ,G- thì có nên không bắt màu thuốc tím -Sau đó rửa bằng dd cồn cho trôi lớp vỏ nhầy đi -Nhỏ dd Fushin thi vi khuẩn G+ có thành tế bào dày hơn nên có màu tim tím đo đỏ ,còn G- có thành tế bào mỏng hơn nên bắt màu đỏ của dd thuốc nhuộm . 1/ Phương pháp nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm phân biệt : Vì giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (gram- positive) bắt màu tím và vi khuẩn G- (gram- negative). sử dụng. Để nhớ ơn đến Christian Gram nên người ta đặt tên của phương pháp ?nhuộm màu này là nhuộm Gram. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có cấu trúc: - Peptidoglican là thành phần thứ yếu, ko chứa. mao của gram (+) thì gốc có 2 vòng khuyên còn vi khuẩn gram (-) gốc có 4 vòng khuyên _về axitamin gram( +) có 3-4 loại còn gram (-) có 17-18 loại _tỉ lệ ARN:ADN ở gram (+) là 8:1 còn gram (-)