GVGD: CÔ NGUYỄN THỊ HUỲNH MAI NHÓM 8: PHAN THỊ BÉ THẢO DƯƠNG QUỐC CƯỜNG NGUYỄN THỊ NGỌC BÍCH HUỲNH THỊ THÚY DiỄM TÌM HIỂU VỀ PHAGE LAMBDA 1.Giới thiệu Năm 1917 các nhà nghiên cứu canada Felix d’herelle xuất bản một bài báo về một chất đối kháng vi sinh vật vô hình của trực khuẩn gây bệnh kiết lỵ. Ông gọi là các bacteriophage virus. Sau đó tên này rút ngắn chỉ thể thực khuẩn.  Năm 1930 Martin Schlessinger xác định kích thướt của một vi khuẩn bằng micromet.  Năm 1951 một sinh viên tại đại học Wisconsin, Ester Lederberg phát hiện thể thực khuẩn lambda, một trong những thể thực khuẩn lambda được sử dụng trong các vector thể thực khuẩn.  Lambda thể thực khuẩn đẵ trở thành đối tượng thực nghiệm vì lý do có thể nhất là cách chia vi khuẩn đã được phát triển như một phương tiện để nghiên cứu vật chủ của nó, E.COLI. Các khám phá như dẫn truyền trung gian của các gen vi khuẩn, kế thừa từ việc nghiên cứu các thể thực khuẩn lambda. 1.1 Định nghĩa Phage lambda  Là AND dạng vòng  Họ: siphoviridae  Lambda thể thực khuẩn có đầu và đuôi  Là thể thực khuẩn ôn hòa.  Đặc điểm của phage lambda:  Kích thước của phage lambda: có chiều dài 48-50 kb. Trong khi đó vector phage lambda gt10 và gt11 được thiết kế có độ dài lên tới 43.34 kb. Vậy nên đoạn DNA có chiều dài khoảng 0-9kb.  Phage lambda : là phage ôn hòa không thực hiện đầy đủ các chu kì phát triển trong tế bào. Những tế bào vi khuẩn khi bị nhiểm phage vẫn tiếp tục phát triển mạnh và các phage này sẽ không ra ngoài tế bào. Hiện tượng này diễn ra sẽ không kèm hiện tượng nhiễm phage độc. trong một trường hợp lí hóa nào đó có thể xảy ra hiện tượng phage ôn hòa trở thành phage độc. 1.2 cấu trúc phage lambda  Thể thực khuẩn là một loại virus của vi khẩn  Lambda thể thực khuẩn là một hạt virus bao gồm một đầu, chứa sợi đôi DNA tuyến tính là vật liệu di truyền của nó, và một cái đuôi có thể có các sợi đuôi. Các hạt thể thực khuẩn nhận diện và gắn với chủ của nó, E. coli, DNA trong đầu của thể thực khuẩn để bị đẩy ra thông qua đuôi vào trong tế bào chất của tế bào vi khuẩn. Điều này dẫn đến lắp ráp của các hạt nhiều thể thực khuẩn mới trong tế bào và ly giải tế bào tiếp theo: bao gồm cả virion đã được lắp ráp, vào môi trường. Tuy nhiên, trong điều kiện nhất định ADN thể thực khuẩn có thể hòa nhập vào nhiễm sắc thể tế bào chủ trong con đường lysogenic( tiềm tan). 1.3 phân loại phage lambda  Lambda promoter : lambda promoter, lambda PL, lambda PR tỏ ra hiệu quả gấp 10 lần so với lac promoter. Sự phiên mã của promoter này bị ức chế bởi sản phẩm của gen lambdaCI. Một đột biến trong repressor, cI857, đưa ra sự mẫn cảm với nhiệt độ.vd: tại nhiệt độ 28 repressor được hoạt hóa và quá trình phiên mã bị ức chế, nhưng ở nhiệt độ 42 repressor bị bất hoạt và promoter được cảm hóa.  Phage lambda cải tiến: chủng lambda dại không thể làm vector tách dòng vì chứa quá nhiều vị trí enzyme cắt, do đó cần tạo ra phage lambda cải tiến dùng cho cách dòng. Nếu biến chủng ở vị trí giới hạn thí một đoạn DNA chuyên biệt của phage co thể mất đi để thay thế bằng một DNA ngoại lai gọi là vetor thay thế. 1.4 Quá trình nhân lên của phage lambda  Sau khi bơm DNA vào tế bào chất hoặc sau khi prophage tách khỏi NST, DNA của phage lambda lặp tức khép vòng và bắt đầu quá trình sao chép. Quá trình tiến hành theo 2 giai đoạn:  Giai đoạn 1:từ phân tử DNA kép, khép vòng tiến hành sao chép theo kiểu theta để tăng số lượng khuôn cho phiên mã và khuôn cho sao chép. Sau đó từ điểm khởi đầu tiến hành sao chép theo hai hướng đối diện nhau và kết thúc khi hai  Giai đoạn 2: sao chép theo cơ chế vòng tròn xoay. Enzyme cắt do phage đã mã hóa nhận biết vị trí chuyên biệt trên cả hai mạch để cắt thành các đoạn genmo. Genmo tạo thành có chiều dài bằng 79-106% chiều dài của genmo lambda bình thường.  Sau khi tổng hợp protein cấu trúc sẽ tiến hành lắp ráp để tạo thành phage hoàn chỉnh 1.5 Chu trình sinh tan  Sau khi xâm nhập, sợi DNA kép của phage lambda lập tức khép vòng và biểu hiện gen. có hai gen được biểu hiện sớm là CI và Cro. Gen CI mã hóa cho protein CI là ức chế lambda. Khi chất này được tích lũy thì sẽ ngăn quá trình phiên mã của các gen muộn. Do đó ngăn cản sinh tan và lambda đi vào con đường tiềm tan.  Gen CRO mã hóa cho protein CRO. Khi protein này được tích lũy sẽ kiểm soát chất ức chế của lambda.  Sự tổng hợp mRNA nhờ RNA polymeraza của vật chủ được khởi đầu từ một số promoter nằm tronh vùng điều hòa. Promoter Pl tiến hành phiên mã gen N để tổng hợp protein N là một chất kháng kết thúc, ngăn cản việc dừng tổng hợp mRNA.  Promotor Pr tiến hành phiên mã gen Cro để tổng hợp protein Cro. Protein này được tổng hợp đồng thời với protein Q. protein Cro có chức năng là chức ức chế. Chu tr Chu tr ình sinh tan và tiềm tan ình sinh tan và tiềm tan Chu trình Tiềm tan Chu trình Sinh tan 1.6 Sinh tan và tiềm tan là phụ thuộc vào công tắc di truyền  ở phage lambda con đường sinh tan hay tiềm tan được kiểm soát bởi công tắc di truyền. Có hai điêu kiện để virus trở thành tiềm tan:  Ngăn cản sự tạo thành các protein muộn  Cài được genmo vào NST của tế bào  Muốn ngăn cản tổng hợp protein muộn thì phải có protein ức chế lambda do gen CI mã hóa. Nếu hoạt hóa được thì protein ức chế lambda được tổng hợp và lambda đi theo con đường tiềm tan.  Sự gắn DNA phage vào NST tế bào: quá trình này diễn ra các bước sau:  Chuỗi DNA dạng thẳng của phage lambda với hai đầu mút dính bắt cặp với nhau tại điểm nối để tạo DNA vòng.  Một số gen sớm được phiên mã để tổng hợp protein sớm.  Khi tế bào vi khuẩn sinh sản, prophage cũng được sao chép cùng với NST của tế bào chủ. [...]...1.7 Các vector phage  Các phage được làm vector chuyển gen do cá khả năng mang gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào nhận  Vector cosmid: cosmid là vector đặc biệt được xây dựng bởi plasmid với đầu cos của phage lambda dùng để tạo dòng các DNA có kích thướt lớn của eukaryote  Một marker kháng kháng sinh và một locus khởi đầu của plasmid  Đoạn DNA mang đầu kết dính có của phage lambda  Kích thướt... (Transduction) Tải nạp là quá trình truyền ADN từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận nhờ phage Có 2 kiểu tải nạp: tải nạp chung và tải nạp đặc hiệu 1.12 ứng dụng của phage lambda  Thể thực khuẩn lambda đã được nghiên cứu tính hữu dụng như là một vector chuyển gen và chủng ngừa  Kỹ thuật tách dòng dùng vector phage lambda thay thế  Sử dụng liệu pháp gen điều trị bệnh ung thư  Các vector liệu pháp dùng... vi khuẩn tromg đất là Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u ( tumor) ở thực vật Nhân tố gây khối u là plasmid Ti (tumor indicing) có DNA vòng, kích thướt khoảng 200kb 1.8 Cơ chế chung của phage lambda Vật liệu di truyền được vận chuyển TB  TB Theo 1 trong 2 cơ chế: Biến nạp (Transformation) Tải nạp (Transduction) và 1.9 Biến nạp (Transformation)  Hiện tượng biến nạp được Frederick Griffith,... chữa bệnh thiếu máu hồng cầu: vector lentivivirus, vector retrovirus…  Chữa bệnh teo cơ sư dụng vector mang cDNA dystrophin bìmh thường vào cơ thể bệnh nhân, nhằm thay thế gen dystrophin bị đột biến  Lambda thực khuẩn thường được sử dụng trong nhân bản DNA . khuẩn lambda. 1.1 Định nghĩa Phage lambda  Là AND dạng vòng  Họ: siphoviridae  Lambda thể thực khuẩn có đầu và đuôi  Là thể thực khuẩn ôn hòa.  Đặc điểm của phage lambda:  Kích thước của phage. loại phage lambda  Lambda promoter : lambda promoter, lambda PL, lambda PR tỏ ra hiệu quả gấp 10 lần so với lac promoter. Sự phiên mã của promoter này bị ức chế bởi sản phẩm của gen lambdaCI phage lambda: có chiều dài 48-50 kb. Trong khi đó vector phage lambda gt10 và gt11 được thiết kế có độ dài lên tới 43.34 kb. Vậy nên đoạn DNA có chiều dài khoảng 0-9kb.  Phage lambda : là phage