Chương 6 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ 1.KHÁI NiỆM LAI PHÂN TỬ - Khi 2 mạch DNA tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ, cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lai. - Đặc điểm: Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA  hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA, hoặc phân tử lai DNA-RNA. 2.Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử.  Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Ở nhiệt độ nhất định, số lượng các trình tự bổ sung càng nhiều thì xác suất bắt cặp càng tăng. Thời gian phản ứng càng dài, xác suất bắt cặp càng lớn, đồng thời số lượng phân tử lai tăng dần.  Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm khoảng 25 %.  Độ dài các trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bình phương của độ dài các trình tự bổ sung.  Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng tăng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2 M hoàn toàn không có tác dụng. 3. Kĩ thuật Southern Blot Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gene, hay những DNA kích thước nhỏ hơn DNA plasmid, phage… Cơ sở : kĩ thuật chuyển DNA từ gel lên màng lai. Đầu tiên, DNA được phân tách trên gel agarose và được tách thành dây đơn (sử dụng muối có nồng độ cao để biến tính) để chuyển từ gel lên màng lai. • Cách tiến hành: - DNA bộ gene được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bởi enzyme cắt giới hạn  điện di để phân tách. - DNA được biến tính ngay trên gel  chuyển lên màng lai (vị trí các đoạn DNA được giữ nguyên). - Tiến hành lai với mẫu dò có đánh dấu (phóng xạ, hóa học…) - Tiến hành rửa  loại bỏ mẫu dò không bắt cặp đặc hiệu - Phát hiện tín hiệu lai. • Ứng dụng: - Lập bản đồ giới hạn của gene - Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm trên gene. Kĩ thuật Southern blot 4. Kĩ thuật Northern blot. Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA. Cách tiến hành: - Điện di RNA trên gel có chất làm biến tính  phá vỡ các liên kết yếu qui định cấu trúc bậc 2 của RNA. - Chuyển RNA lên mang lai - Tiến hành lai với mẫu dò có đánh dấu. - Phát hiện tín hiệu lai Kĩ thuật Northern blot. 5. Kĩ thuật Western blot. Phương pháp phát hiện protein trên gel polyacrylamide chuyển đến một môi trường bền vững hơn và cố định (ví dụ: màng nitrocellulose) với những nguyên tắc tương tự như Southern blot. Cách tiến hành: Thu nhận protein từ tế bào nuôi cấy  xử lý protein (sử dụng SDS, nhiệt độ, DTT để biến tính protein). Tiến hành điện di SDS-PAGE  phân tách protein. Chuyển lên màng lai Tiến hành lai với kháng thể có đánh dấu. Phát hiện tín hiệu lai. Kĩ thuật Western blot Thu nhận và điện di protein Lai và phát hiện 6. Các hệ thống đánh dấu  Hệ thống đánh dấu không dùng đồng vị phóng xạ: - Horseradish peroxydase (HRP) và chemiluminescence HRP oxi hóa cơ chất (Luminol )  cơ chất ở trạng thái kích thích, phát sáng ở độ dài sóng 425 nm. [...]... Hệ thống biotin – streptavidin Streptavidin là một protein có trọng lượng phân tử 60.000 Da, với 4 tiểu đơn vị đồng nhất, mỗi tiểu đơn vị có thể gắn với một phân tử biotin  Hệ thống đánh dấu phóng xạ Trong phương pháp này người ta sử dụng một loại phim để phát hiện “mẫu dò”(probe) được đánh dấu bằng P32 , phim này rất nhạy cảm với bức xạ . Chương 6 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ 1.KHÁI NiỆM LAI PHÂN TỬ - Khi 2 mạch DNA tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ, cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lai. - Đặc. tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA  hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA, hoặc phân tử lai DNA-RNA. 2.Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử.  Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Ở nhiệt độ. lượng phân tử lai tăng dần.  Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm khoảng 25 %.  Độ dài các trình tự Tốc độ lai