Phần MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ lâu người gắn bó, gần gũi với thiên nhiên Thiên nhiên nơi mang đến cho người nhiều q tặng vơ giá, q vơ giá hoa Hoa làm cho sống người thêm phần thi vị ý nghĩa Khi đời sống ngày nâng cao, người ngày hướng tới hưởng thụ, thưởng thức đẹp nhu cầu hoa lại khơng thể thiếu Từ mà nghề đời đem lại lợi nhuận lớn nghề trồng kinh doanh hoa Cùng với phát triển không ngừng xã hội, nhu cầu hoa ngày lớn địi hỏi nghề trồng hoa phải có giống hoa lạ, hấp dẫn để đáp ứng thị hiếu thị trường Hoa lily (Lilium longoflorum) lồi hoa cao cấp đẹp quyến rũ, màu sắc phong phú, có hương thơm độ bền hoa cắt cành cao (10-15 ngày), dễ thu hoạch bảo quản chiếm lĩnh thị trường hoa tươi giới Việt Nam Hoa Lily khơng để trang trí mà cịn sử dụng để điều chế nước hoa, mỹ phẩm, kem chống lão hố Do hoa Lily loại hoa mang lại lợi nhuận lớn Hiện nay, nước ta giá trung bình thị trường cành hoa Lily từ 15.000 đến 30.000 VN đồng/cành, chí 60.000 VN đồng/cành vào ngày lễ tết Ở Việt Nam hoa Lily trồng thành công nhiều tỉnh Lâm Đồng, Lào Cai, Hà Nội Tuy nhiên, phải thường xuyên nhập giống từ nước ngồi với chí phí cao (10.000-15.000đồng/củ giống) khơng chủ động nguồn giống Kỹ thuật nhân giống vô tính in-vitro với ưu điểm nhân nhanh cá thể đồng mặt di truyền, sinh trưởng phát triển cách đồng cho hệ số nhân giống cao Chỉ cần lượng nhỏ nguyên liệu ban đầu, nuôi cấy môi trường dinh dưỡng điều kiện thích hợp thu lượng lớn (hoặc củ) giống thời gian ngắn nhiều so với phương pháp truyền thống khác Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới hình thành củ từ vảy củ hoa Lily (Lilium longiflorum) phương pháp nuôi cấy mô tế bào” Mục tiêu đề tài Xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo củ hoa Lily từ nuôi cấy vảy củ phương pháp nuôi cấy mô tế bào Nội dung đề tài - Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu nuôi cấy - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ saccharose đến khả tạo củ in vitro hoa Lily - Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả tạo củ in-vitro hoa Lily - Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả nhân nhanh củ in-vitro hoa Lily - Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến khả tạo củ hoa Lily Phần hai TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu Lily 2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại thực vật hoa Lily Cây hoa Lily có tên khoa học Lilium longiflorum Thumb., họ Liliaceae, phụ thực vật mầm Cây hoa Lily có nguồn gốc từ Nhật Bản nước Châu Âu Hoa Lily trồng Đà Lạt từ năm 1945 với giống Hà Nội Từ 1970, Đà Lạt nhập giống Lily từ Hàn Quốc, Nhật Bản Hiện nay, hoa Lily trồng phổ biến nhiều nơi Hà Nội, Đà Lạt Theo hệ thống phận loại Takhtajan Lily thuộc ngành hạt kín Angiospermae, lớp mầm Monocotyledoneae hay lớp loa kèn Liliopsida, phân lớp loa kèn Liliae, loa kèn Liliales, họ loa kèn Liliaceae (Hoàng Thị Sản, 2003; Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy, 2001) Họ Liliaceae họ lớn với 200 chi 3000 lồi Chi Lilium gồm khoảng 220 lồi, có số loài trồng cách 3000 năm Sau năm 1950, khoảng 100 giống Lily lai tạo đăng ký tên giới với nhiều giống lai có nguồn gốc từ hai lồi Nhật Bản L.auratum L.speciosum (Pelkonen, 2005) [1], [5] Trung Quốc nước có nhiều chủng loại Lily trung tâm, nguồn gốc Lily giới Theo kết điều tra, Trung Quốc có khoảng 460 giống, 280 biến chủng (chiếm 1/2 tổng giống hoa Lily giới), có 136 giống, 52 biến chủng Trung Quốc tạo Nhật, Hàn Quốc có 110 giống có 30 giống mang đặc trưng nước Hà Lan có khoảng 320 giống, 805 giống Hà Lan tạo ra… Cuối kỷ XVI, nhà thực vật học người Anh phát đặt tên cho giống Lily Đầu kỷ XVII Lily di thực từ Châu Âu đến Châu Mỹ Sang kỉ XVIII giống Lily Trung Quốc di thực sang Châu Âu vẻ đẹp mùi thơm hấp dẫn nên Lily nhanh chóng phát triển coi hoa quan trọng Châu Âu, Châu Mỹ Vào cuối thể kỷ thứ XIX bệnh virut Lily lây lan mạnh, tưởng chừng Lily bị hủy diệt Đến đầu kỷ XX người ta phát giống Lily thơm Trung Quốc (L.regane) có khả chống chịu tốt với bệnh virut, giống nhập vào Châu Âu chúng dùng vào việc lai tạo giống để tạo nhiều giống có tính thích ứng rộng, khả chống chịu sâu bệnh tốt, Lily lại phát triển mạnh mẽ 2.1.2 Đặc điểm hình thái Lily lồi thân ngầm đất có nhiều vảy bao bọc lại nên người ta gọi hoa bách hợp Lily thân thảo lâu năm Phần mặt đất gồm thân vảy, rễ Phần mặt đất gồm lá, thân, mầm hạt (một số mầm hạt) - Thân vảy (củ): phần phình to thân tạo thành, màu trắng màu hồng nhạt, phía ngồi khơng có màng bao bọc nên gọi thân vảy trần (không vỏ, thân vảy củ giống để trồng).[14] - Rễ: có hai tầng, rễ mọc gốc thân vảy gọi rễ gốc, to, mềm, có củ giống mọc sau trồng Rễ mọc nơi tiếp giáp củ thân mặt đất gọi rễ thân - Lá: mọc rãi rác thành vịng thưa, hình kim, x hình thn, hình giải, đầu nhọn, dài 10 - 15cm, rộng từ 1,5 - 2cm, có cuống khơng có cuống, có từ - gân, gân rõ ràng hơn, mềm màu xanh bóng - Thân: trục thân mang nhiều lá, nách mọc lên mầm hạt (củ con) - Củ mầm hạt: đại phận Lily có nhiều củ gần thân rễ, có chu vi từ 0,5 - 3cm, số lượng củ tuỳ thuộc giống điều kiện trồng trọt - Hoa: hoa đều, lưỡng tính, hoa mẫu ba Hoa lớn có mọc đơn độc mọc thành cụm Bao hoa đơn, dạng cánh, không phân hoá thành đài tràng rõ rệt, gồm sáu cánh xếp xen kẽ nhau, cánh hợp lại thành hai vịng khác khơng dính Bộ nhị gồm có nhị, có cuống màu xanh nhạt, gắn với thành hình chữ T Trục hoa nhỏ dài, đầu trục phình to, có khía, tủ phịng phía Màu sắc hoa phong phú, đẹp Có màu trằng, màu vàng, màu tím nhiều màu Màu cánh thường đơn sắc có chấm màu nâu, màu tím, có hương thơm - Quả: hình trứng dài, có vài trăm hạt, bên có ba ngăn Hạt hình dẹt, xung quanh có cánh mỏng, hình bán cầu, ba góc, vng dài 2.1.3 Phân loại giống hoa Lily Do việc mua bán Lily giới phát triển, nên công tác lai tạo giống ý mở rộng, giống ngày nhiều Để tiện cho việc mua bán, hiệp hội làm vườn Hoàng gia Anh (Royal Horticultural society Lily commitie) năm 1963 đưa hệ thống phân loại Lily Hệ thống chủ yếu vào nguồn gốc bố mẹ lai, tác giả tạo giống năm tạo giống từ người ta chia giống Lily trồng trọt làm nhóm: - Nhóm 1: Nhóm Lily Phương Đông: gồm chủng: L.auratum, L.spucicsum, L.faponicum, L.rubellum chủ yếu giống lai có nguồn gốc khác - Nhóm 2: Nhóm Lily Á châu: gồm L.lancipollium, L.lechttini var maximwicgii, L.caculamabel, L.pumilum, L.bulboerem, L.dacidu, L.wiblanotiac chủ yếu nhóm Carotuoid - Nhóm 3: Nhóm Lily thơm: với chủng L.langflorcum, Lily Đài Loan (L.porosanum), Lily trắng (L.candidum), Lily Vương (L.regala) - Nhóm 4: Nhóm Lily Tinh Diệp: gồm Lily Hán Lâm (L.hansoni), Lily Tinh Diệp (L.martagou) với L.chalcudonicum, Lily ốc đan lai tạo chọn lọc Năm 1982, Hiệp hội Lily quốc tế đề hệ thống phân loại Lily sở Hệ thống phân loại Anh năm 1963 Hệ thống dựa vào nơi nguyên sản bố mẹ, quan hệ huyết thống, đặc trưng hình thái, màu sắc hoa quy giống Lily vào nhóm: - Nhóm Lily lai Á châu (Asiatic hybrids) Do loại Lily Châu Á lai với lai (lai lai bố mẹ chủ yếu Lily triển tiêu (L.mabile), Lily thân vảy (L.bullierum var croceum), L.xhollamdicum, L.xmaculatum, L.xelegans, Lily lông (L.danricum), Lily ốc đan (L.aoncoor, L.lancipolium, L.dacicii, L.cernum) Nhóm có đặc điểm hoa hướng ra, màu hoa phong phú Dựa vào hình dáng hoa nhóm lại phân làm loại: + Loại hoa hướng lên trên: Mọc đơn hoa tự, hoa sớm Các giống thường thấy là: Apeldoora, Enchatmemt, Conmicticusking + Loại hoa hướng ngoài: giống thường thấy là: Braudwine, Corsage, Proopierity + Loại hoa chúc xuống: giống thường thấy BlackButtylly, Conneticutyan, Wtonella - Nhóm Lily lai Tinh Diệp (Martagon hybrids) Do lai L.martagon x L.hansonii Các giống thường thấy Marhan, Achievement, Graylights, Baollerina, Dairy, Maid - Nhóm Lily lai hoa trắng (Condidum hybrids) Các giống thường thấy là: Beerensiik, Prankfonce, Hughes Apiricot, Whito Might - Nhóm lai Lily Châu Mỹ (American hybrids) Bắt nguồn từ L.paradalinum, L.parrue, sinh trưởng Châu Mỹ Các giống thường thấy là: Shuksau, Belliungham, Bellauaud - Nhóm lai Lily thơm (Longgiflorum hybrids) Còn gọi Lily pháo Lily thơm (L.longiflỏum), Lily Đài Loan (L.porosanum) lai tạo ra, đặc điểm hoa có hình dáng giống loa kèn, giống thường thấy là: Avita Come, Gelria, Snow Qeen - Nhóm Lily lai loa kèn (Trumpet hybrids) Bắt nguồn từ Lily Thông Giang (L.sargeutac), Lily Nghi Xương (L.lecauthum), Lily Hồ Bắc, Lily Vương lai với Dựa vào hình dạng hoa chia ra: + Hình hoa loa kèn, có giống: Apricau Qeen, Black Dragon, Black Magic + Hoa hình bát, thường thấy là: Firstlove, Hertsdesire, Newera + Hoa chúc xuống cong ngược lại, giống thường thấy là: Christmas day, Golldin Showers, Summer Song + Hình mặt trời mọc, cành hoa cong lại, giống thường thấy là: Brightstar, Golden sunburst, Magic - Nhóm lai Phương Đơng (Oriental hybrids) L.aurtum, L.spociosum, Lily đỏ (L.rubellum), Lily Nhật (L.piponcum) lai với Lily Hồ Bắc tạo Căn vào hình dáng hoa, nhóm lại phân làm loại: + Loại hình hoa loa kèn (hiện chưa có giống đăng ký) + Loại hình hoa hình bát, giống thường thấy là: Bonpire, Casa Blanca, Empiress, Opchina + Loại hình hoa dài cánh hoa cong ngược lại - Nhóm Lily nguyên chủng Bao gồm tất loại, biến chủng biến hình nguyên xuất xứ [5] Ở Việt Nam, ngồi giống hoa Loa kèn màu trắng trồng, phát hai loài Bách Hợp (L.Brownii F.E Brown var oldiesterri wils) mọc hoang dại núi đá Lạng Sơn, Cao Bằng lồi L.poilanei Gagenep có đồi cỏ Sa Pa, Hoàng Liên Sơn [20] 2.1.4 Điều kiện sinh thái Cây Lily sinh trưởng, phát triển tốt đáp ứng đầy đủ yêu cầu điều kiện sinh thái Trong yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, nước, khơng khí, đất dinh dưỡng yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát dục Các yếu tố thay cho tác động tương hỗ lẫn nhau, thiếu yếu tố cho sinh trưởng phát triển Lily - Nhiệt độ Nói chung Lily chịu rét khá, chịu nóng kém, ưa khí hậu mát ẩm, nhiệt độ thích hợp ban ngày 20 - 25 0C, ban đêm 120C Các giống thuộc nhóm tạp giao Phương Đơng thời kỳ đầu thích hợp nhiệt độ ban ngày 20 0C, ban đêm 150C Nhóm Lily thơm chịu nóng tốt, nhiệt độ thích hợp: ban ngày 25- 28 0C, ban đêm 18 - 200C Dưới 120C sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù, thời gian đầu nhiệt độ thấp có lợi cho rễ phân hố hoa Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát dục Lily, quan trọng ảnh hưởng đến nảy mầm hạt, phát dục thân sinh trưởng lá, điều tiết phân hoá hoa hoa - Ánh sáng Lily ưa cường độ ánh sáng trung bình từ 12000- 15000lux, trồng vào mùa Hè phải che bớt ánh sáng, thời kỳ cao 20 - 30cm Vào mùa Hè với nhóm Lily Á châu Lily thơm cần che bớt 50% ánh sáng, nhóm Phương Đơng nên che bớt 70% ánh sáng Ngược lại trồng nhà kính vào mùa Đơng, ánh sáng không đủ, nhị đực sản sinh etylen, dẫn đến rụng nụ Đặc biệt nhóm Á châu mẫn cảm với thiếu ánh sáng, cần bỏ bớt lưới nilon che phủ để tăng cường ánh sáng tự nhiên cho Lily dài ngày, chiếu sáng nhiều hay ngắn ảnh hưởng tới phân hố hoa, mà cịn ảnh hưởng đến sinh trưởng phát dục hoa Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng tới sinh trưởng phát dục củ - Nước Đất khô nhiều nước ảnh hưởng đến sinh trưởng phát dục Lily Thời kỳ đầu cần nhiều nước, thời kỳ hoa nhu cầu nước giảm bớt nước nhiều củ dễ bị thối rụng nụ Lily thích khơng khí ẩm uớt, ẩm độ thích hợp 80 - 85% Nếu ẩm độ biến động lớn dễ dẫn đến thối củ - Không khí Lily mẫn cảm với khí etylen, nhiên độ mẫn cảm giống khác khơng giống nhau: giống Á châu mẫn cảm nhất, dịng giống khác yếu - Đất Lily trồng loại đất, đất nhiều mùn, đất thịt nhẹ tốt Lily loại có rễ nơng đất nước quan trọng Lily mẫn cảm với muối, đất nhiều muối không hút nước, ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hố hoa hoa Nói chung hàm lượng muối khơng vượt q 15mg/cm2, chất oxy hố khơng cao 1,5mmol/l Đất chua hút ion sắt, nhôm, magie nhiều gây hại cho cây; đất kiềm quá, lượng hút sắt, magie, lân không đủ dẫn đến thiếu sắc tố Các giống thuộc nhóm tạp giao Á châu Lily thơm yêu cầu độ pH thích hợp từ - 7, giống thuộc nhóm Phương Đơng lại yêu cầu thấp (pH từ 5,5 - 6,5) - Dinh dưỡng Lily yêu cầu mức độ phân bón cao ba tuần đầu kể từ sau trồng Tuy nhiên, lúc rễ non dễ bị ngộ độc muối Muối đất có từ ba nguồn: phân bón, nước tưới hàm lượng dinh dưỡng trồng trước vụ trước Vì để tránh tác hại muối đất, trước trồng tuần cần phân 10 Trong điều kiện thông thường, sản phẩm q trình quang hợp nguồn chất hữu tích lũy cho hình thành củ Nhưng điều kiện in vitro, lượng chất hữu lấy chủ yếu từ môi trường nuôi cấy Ở thí nghiệm chúng tơi nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường saccharose: 30g/l – 60g/l – 90g/l – 120g/l đến trình tạo củ Lily in vitro từ lát cắt vảy củ Kết ghi lại sau tuần theo dõi trình bày bảng 4.3 sau: Bảng 4.3 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến trình tạo củ Lilium aziatische “Birthday” (sau tuần nuôi cấy) CT Saccharose (g/l) 30 60 90 120 Tỷ lệ phát sinh củ (%) 1,1 1,5 3,9 3,2 Qua kết bảng 4.3, ta thấy đường saccharose kích thích q trình tạo củ, tăng kích thước củ Khi ta tăng nồng độ đường từ 30mg/l lên 60mg/l lên 90mg/l tỷ lệ phát sinh củ tăng lên đặc biệt nồng độ 90mg/l, tỷ lệ phát sinh củ tăng gần gấp đôi so với nồng độ 60mg/l (từ 1,5 lên 3,9) Tuy nhiên nâng nồng độ đường cao lên tỷ lệ phát sinh củ lại có xu hướng giảm Do đó, để thu tỷ lệ phát sinh củ cao ta nên chọn hàm lượng đường mức 90mg/l cho thí nghiệm 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ lát cắt vảy củ Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (phytohormone) thành phần quan trọng bậc môi trường nuôi cấy Nhờ chất này, nhà nghiên cứu 38 chủ động điều khiển q trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Đặc biệt, cytokinin liên quan chặt chẽ đến trình phân bào, trì trẻ hố quan làm giảm tượng ưu ngọn, kích thích phân hố mầm chồi từ mơ sẹo ni cấy Trong thí nghiệm này, nghiên cứu ảnh hưởng BAP nồng độ khác 0,1mg/l – 0,3mg/l – 0,5mg/l – 0,7mg/l - 1mg/l đến khả tạo chồi từ lát cắt vảy củ Lily Kết ghi lại sau tuần theo dõi trình bày bảng 4.4 biểu đồ 4.2: Bảng 4.4 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ lát cắt vảy củ Lilium aziatische “Birthday” (sau tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu Công thức ĐC (0,0mg BAP) I (0,1mg BAP) II (0,3mg BAP) III (0,5mg BAP) IV (0,7mg BAP) V (1,0mgBAP) Hệ số nhân Số lá/chồi (lá) chồi (lần) 2,3 2,8 3,0 4,6 3,9 3,2 0,7 1,2 1,8 5,3 3,2 2,4 Chiều dài chồi (cm) 0,4 0,8 0,9 2,5 2,0 1,1 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ lát cắt vảy củ Lilium aziatische “Birthday” (sau tuần nuôi cấy) 39 Qua kết bảng 4.4 biểu đồ 4.2 kết hợp với q trình quan sát thí nghiệm thấy rằng: Mơi trường có bổ sung BAP nồng độ 0,5mg/l cho số lượng chồi nhiều (4,6 chồi/lát cắt vảy củ), chất lượng chồi tốt, đồng đều, to khoẻ, nhiều (5,3 lá/chồi, chiều dài chồi trung bình 2,5cm) thời gian xuất chồi ngắn (sau 17 ngày ni cấy) Cịn với mơi trường bổ sung BAP nồng độ 0,1 – 0,3mg/l cho hệ số nhân thấp (2,8 – 3,0 chồi/lát cắt vảy củ), chồi nhỏ yếu, phát triển chậm (chiều dài chồi 0,8 – 0,9cm, 1,2 – 1,8 lá/chồi) thời gian xuất chồi kéo dài (28 – 33 ngày) Môi trường bổ sung BAP nồng độ từ 0,7 – 1mg/l có số chồi nhiều so với nồng độ – 0,3mg/l phát triển yếu, có tạo callus, thời gian xuất chồi dài so với nồng độ 0,5mg/l ngày (sau 26 ngày ni cấy) BAP có ảnh hưởng lớn đến khả tạo chồi lát cắt vảy củ in vitro Theo Vũ Văn Vụ, sử dụng cytokinin với nồng độ thích hợp mang lại hệ số tạo chồi cực đại, mức thấp biểu hiệu kích thích kém, dẫn đến tạo chồi sinh trưởng chồi giảm Với hàm lượng cytokinin cao hoạt hố hình thành chồi bất định, gây độc cho Tóm lại, mơi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP môi trường tối ưu để tái sinh chồi, chồi từ công thức sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm 40 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả nhân nhanh Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng BAP α–NAA đến khả nhân nhanh chồi Lily Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng mơi trường có bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l (nồng độ tối ưu thí nghiệm trên) thay đổi nồng độ α–NAA: 0,05mg/l – 0,07mg/l – 0,1mg/l Kết đánh giá sau tuần theo dõi trình bày bảng 4.5 biểu đồ 4.3: Bảng 4.5 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả nhân nhanh chồi Lily Chỉ tiêu Hệ số Chiều dài Số nhân chồi (cm) lá/chồi 4,65 6,04 7,34 (lá) 5,47 6,23 7,8 Công thức 0,5mg/l BAP + 0,05mg/l α–NAA 0,5mg/l BAP + 0,07mg/l α–NAA 0,5mg/l BAP + 0,1mg/l α–NAA (lần) 2,76 3,23 5,47 41 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả nhân nhanh chồi Lilium aziatische “Birthday” (sau tuần nuôi cấy) Kết bảng 4.5 biểu đồ 4.3 kết hợp với trình quan sát thí nghiệm cho thấy rằng: Trong q trình quan sát thí nghiệm thấy rằng, mơi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP 0,1mg/l α–NAA làm tằng số chồi cao (5,47 lần), chất lượng chồi tốt nhất, đồng đều, to khoẻ (7,8 lá/chồi, chiều dài chồi 7,34cm), có hình thành rễ rễ phát triển Còn với 0,5mg/l BAP 0,05 – 0,07mg/l α– NAA hệ số nhân chồi thấp (2,67 3,22 lần) có số chồi phát triển tương đối tốt, khơng tốt mơi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP 0,1 mg/l α–NAA, mẫu có khả sử dụng để tạo hồn chỉnh Trong mơi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP 0,07mg/l α–NAA số chồi có hình thành callus Theo Bhojwani (1980), số lồi, mơi trường ni cấy có loại cytokinin cho hệ số tạo chồi cực đại Với ngũ cốc phối hợp hai hay nhiều loại cytokinin cho kết tốt sử dụng cytokinin riêng rẽ Tuy nhiên muốn có tương quan sinh trưởng tối ưu phải cần hoocmon thích hợp Nhiều tác giả tổng kết biệt hoá quan thực vật in vitro 42 kết tác động qua lại hai nhóm auxin cytokinin Tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích tạo rễ, trái lại đẩy mạnh biệt hoá chồi, cịn tỷ lệ trung gian mơ sẹo hình thành Đó ngun tắc chung, cịn phản ứng loại mơ khơng giống Vì loại mơ, giai đoạn sinh trưởng khác tổ hợp nồng độ auxin/cytokinin quan trọng Vậy tỷ lệ auxin/cytokinin thay đổi khả tạo chồi thay đổi, thí nghiệm thấy tỷ lệ cao khả tạo chồi cao, với tỷ lệ α–NAA/BAP = 1/50 – 1/10 hệ số nhân chồi tăng lên từ 2,67 – 3,32 lần, tỷ lệ α-NAA /BAP = 1/5 hệ số nhân chồi 5,47 lần Trong thí nghiệm mơi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP 0,1mg/l α–NAA mang lại hiệu cao nhất, nhiên chưa thể khẳng định mơi trường tối ưu chưa có giảm dần hệ số nhân chồi 43 Phần năm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trên sở kết thực nghiệm, bước đầu rút kết luận sau: Sử dụng hố chất NaClO 2% 12 phút có hiệu khử trùng vảy củ Lilium aziatische “Birthday” cao Chế độ tối hoàn toàn chế độ chiếu sáng tối ưu cho việc tao củ từ vảy củ Lilium aziatische “Birthday” Mơi trường MS có bổ sung đường saccharose với hàm lượng 90g/l thích hợp cho việc tạo củ từ vảy củ Lilium aziatische “Birthday” Mơi trường MS có bổ sung 0,5mg/l BAP thích hợp cho việc tái sinh chồi từ vảy củ Mơi trường MS có bổ sung 0,5mg/l BAP 0,1 α–NAA thích hợp cho việc nhân nhanh chồi 5.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến khả tạo củ từ vảy củ hoa Lily, đặc biệt nghiên cứu phá ngủ nghỉ củ Lily Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng α–NAA đến khả tạo rễ với nồng độ lớn 0,1mg/l Nghiên cứu thêm môi trường nuôi cấy khác đến khả nhân nhanh tạo rễ lồi Lilium nói chung Lilium aziatische “Birthday” nói riêng Nghiên cứu thêm giai đoạn sau nuôi cấy in vitro giai doạn vườn ươm với giá thể khác để biết khả sinh trưởng Lily in vitro Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình nhân nhanh hoa Lilium azatische “Birthday” phương pháp nuôi cấy in vitro 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Vũ Lan Anh, 2006, Hồn thiện quy trình nhân nhanh hoa Lilium Topgum phương pháp nuôi cấy lát cắt mỏng vảy củ nhân giống in vitro, Báo cáo khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Quang Thạch, 2005, Nghiên cứu tao củ in vitro sinh trưởng Lily trồng từ củ in vitro Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn (kỳ 1, tr 33 - 35) Lê Trần bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997, Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, (Giáo trình cao học nơng nghiệp), NXB nơng nghiệp Hà Nội Lê Hữu Cần, Nguyễn Xuân Linh, 2003, Giáo trình Hoa Cây cảnh, NXB nơng nghiệp Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2004, Công nghệ trồng hoa cho thu nhập cao - Cây hoa Lily, NXB Lao động - xã hội Hà Nội Trần Khắc Hạnh, 2004, Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cúc CN 01 (Standard Chrysanthemum) phương pháp nuôi cấy in vitro, Báo cáo khoá luận tốt nghiệp Hồ Thị Mỹ Hạnh, 2007, Nghiên cứu quy trình nhân nhanh hoa Lilyum Aziatische "Birthday" phương pháp nuôi cấy in vitro phát triển cảu Lily trồng từ in vitro Báo cáo khoá luận tốt nghiệp Dương Thị Thu Hương, 2001, Nghiên cứu nhân nhanh giống hoa Loa Kèn chịu nhiệt Lilium formolongo phương pháp nuôi cấy in vitro Dương Công Kiên, 2002, Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 10 Dương Công Kiên, 2003, Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Xuân Linh, 1998, Hoa kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp Hà Nội 12 Mai Xuân Lương, 1993, Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa huệ tây, NXB Nông nghiệp 45 13 Nguyễn Hồng Lộc, 1993, Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, 14 Lương Văn Mạnh, 2002, Nghiên cứu phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens vào Lily 15 Trần Văn Minh, 1995, Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình Đại học, Viện Đại Học mở bán cơng TP Hồ Chí Minh 16 Dương Tấn Nhựt, 1994, Nhân giống hoa huệ tây phương pháp ni cấy vảy củ, Tạp chí sinh học 17 Dương Tấn Nhựt, Trần Ngọc Thuỷ Tiên, Mai Thị Ngọc Hương, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phan Xuân Huyền, Bùi văn Lệ, Đỗ Năng Vịnh, Một số kết nghiên cứu hạt nhân tạo hoa Lily (Lilium spp), Tạp chí cơng nghệ sinh học 2, 3, tr 359 - 370 18 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô công tác nhân giống hoa Loa Kèn 19 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo, 2005, Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 20 Lê Hồi Thanh, 2005, Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới hình thành củ hoa Lily phương pháp ni cấy mơ tế bào Báo cáo khố luận tốt nghiệp 21 Dương Thanh Thuỷ, 2006, Bài giảng công nghệ sinh học ứng dụng 22 Cao Thị Huyền Trang, Đỗ Năng Vịnh, Vũ văn Vụ, 2006, Nghiên cứu tạo mô sẹo phơi hố, phơi vơ tính từ lát cắt bầu nhuỵ vòi nhụy giống Lilium Oriental Sorbone, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn (kỳ tháng 4/2006, tr 39 - 41) 23 Vũ Văn Vụ, 1999, Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo duc 24 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, 2007, Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục 46 PHỤ LỤC ẢNH Hình 1: Vảy củ Lily sau khử trùng đưa vào môi trường nuôi cấy 47 Hình 2: Khả tạo củ từ vảy củ 48 Hình Khả tạo củ từ lát cắt vảy củ 49 Hình 3: Sự tái sinh chồi mơi trường MS có bổ sung BAP (sau tuần ni cấy) 50 Hình 4: Sự nhân nhanh chồi mơi trường MS có bổ sung 0,5mg/l BAP 0,1 mg/l α – NAA (sau tuần nuôi cấy) 51 Môi trường MS (Murashige-Skoog) Ký hiệu MS2 MS3 MS4 MS5 Nồng độ (mg/l) Dung dịch stock (mg/l) KNO3 KH2PO4 NH4NO3 MgSO4.7H2O 1900 170 1650 370 38000 3400 33000 7400 CaCl2.2H2O 440 8800 H3BO3 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O CuSO4 ZnSO4 Na2MoO4.2H2O KI 6.2 22.3 0.025 0.025 8.6 0.025 0.83 1240 4460 5 1720 166 FeSO4.7H2O Na2-EDTA 27.8 37.3 1112 1492 25 Myo-inositol MS1 Hoá chất 100 10000 10 B1 B6 Acide nicotinic Glycine 0.1 0.5 0.5 20 100 100 400 52 ml/lít mơi trường 50 50 5 ... Xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo củ hoa Lily từ nuôi cấy vảy củ phương pháp nuôi cấy mô tế bào Nội dung đề tài - Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu nuôi cấy - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ... phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới hình thành củ từ vảy củ hoa Lily (Lilium longiflorum) phương pháp nuôi cấy mô tế bào? ?? Mục tiêu đề tài Xác định yếu. .. củ, đặc điểm củ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường đến hình thành củ từ nuôi cấy vảy củ Các vảy củ khử trùng đảm bảo sống bệnh sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm Các vảy củ cấy